EMSA PAGE凝膠配制試劑盒
PAGE
Electrophoresis Kit for EMSA
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貨号
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名稱
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規格
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RTE4104
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EMSA PAGE凝膠配制試劑盒
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30-60次
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● 産品組成：
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貨号
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名稱
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規格
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貯存
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RTE4104-01
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40%PAA(37.5:1)
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50 ml
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4℃，避光(guāng)
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RTE4104-02
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5×TBE
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50 ml
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RT
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RTE4104-03
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80%甘油
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20 ml
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RT
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AP020P
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APS（幹粉）
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5 ml
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RT（配制後-20℃貯存）
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TA0761-01
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TEMED
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0.5 ml
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4℃，避光(guāng)
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● 産品簡介：
EMSA PAGE凝膠配制試劑盒(PAGE Gel Preparation Kit for PAGE)提供了配制EMSA PAGE凝膠所需的各種試劑，用戶隻需自(zì)備制膠器具和蒸餾水，即可(kě)配制不同濃度的EMSA PAGE凝膠。凝膠遷移實驗(也稱凝膠阻滞實驗或電泳遷移率實驗)
(Electrophoretic mobility shift assay, EMSA)，也稱Gel Shift，是一種用于研究蛋白(bái)與核酸相(xiàng)互作(zuò)用的高靈敏實驗技術(shù)。主要用于轉錄因子與啓動子相(xiàng)互作(zuò)用的驗證性實驗，也可(kě)應用于蛋白(bái)與DNA、蛋白(bái)與RNA相(xiàng)互作(zuò)用研究。EMSA技術(shù)基于進行非變性聚丙烯酰胺或瓊脂糖凝膠電泳時，蛋白(bái)質與DNA或RNA複合物的遷移速度比遊離(lí)線性DNA或RNA片段慢(màn)，從(cóng)而導緻DNA或RNA遷移位置在與蛋白(bái)質結合時滞後。
本試劑盒大(dà)約可(kě)以配制30-50塊常規大(dà)小（8×10 cm）PAGE凝膠，具體(tǐ)數量根據凝膠厚度決定：0.75mm厚度凝膠可(kě)以配制60塊膠，1 mm厚度凝膠可(kě)以配制至少45塊膠，1.5 mm厚度凝膠可(kě)以配制至少30塊膠。
● 貯存和效期：
本産品常溫運輸，按照(zhào)标簽溫度貯存；有效期一年(nián)。
● 使用說(shuō)明：
10% APS配制-5 ml：
将0.5 gAPS幹粉溶于5 ml滅菌水中，徹底溶解後分(fēn)裝，1 ml/支，-20℃備存，每次取一管使用。10% APS應盡量減少常溫存放(fàng)時間，以防失效，若發現凝膠聚合時間延長，應考慮更換使用-20度保存的10% APS。
一、制備凝膠步驟：
1.1 參照(zhào)凝膠模具說(shuō)明書(shū)，裝配好凝膠模具。
1.2按照(zhào)表格将不同體(tǐ)積的成分(fēn)在小燒杯或試管中混合；最後加入10%APS和TEMED，輕輕攪拌使其混勻，避免産生(shēng)氣泡。配制一塊常用EMSA PAGE膠(8×10 cm)所需凝膠溶液體(tǐ)積：0.75 mm厚度凝膠約5 ml；1 mm厚度凝膠約7 ml；1.5 mm厚度凝膠約10 ml。均含約0.5 ml的餘量。
EMSA PAGE凝膠配方表一 (0.75 m厚度凝膠)：
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總體(tǐ)積5 ml，适用于厚度0.75 mm小闆膠
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各組份體(tǐ)積（ml）
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最佳DNA分(fēn)離(lí)範圍
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膠濃度
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滅菌水
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40%PAA(37.5:1)
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80%甘油
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5×TBE
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10%APS
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TEMED
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4%
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3.8
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0.5
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0.156
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0.5
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0.05
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0.005
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5%
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3.66
|
0.625
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0.156
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0.5
|
0.05
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0.005
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6%
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3.54
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0.75
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0.156
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0.5
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0.05
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0.005
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EMSA PAGE凝膠配方表二 (1.0 mm厚度凝膠)：
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總體(tǐ)積7 ml，适用于厚度1 mm小闆膠
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各組份體(tǐ)積（ml）
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最佳DNA分(fēn)離(lí)範圍
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膠濃度
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滅菌水
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40%PAA(37.5:1)
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80%甘油
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5×TBE
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10%APS
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TEMED
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4%
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5.3
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0.7
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0.22
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0.7
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0.07
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0.007
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5%
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5.2
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0.875
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0.22
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0.7
|
0.07
|
0.007
|
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6%
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5.0
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1.05
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0.22
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0.7
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0.07
|
0.007
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EMSA PAGE凝膠配方表三 (1.5 mm厚度凝膠)：
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總體(tǐ)積10 ml，适用于厚度1.5 mm小闆膠
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各組份體(tǐ)積（ml）
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最佳DNA分(fēn)離(lí)範圍
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膠濃度
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滅菌水
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40%PAA(37.5:1)
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80%甘油
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5×TBE
|
10%APS
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TEMED
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4%
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7.6
|
1
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0.313
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1
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0.1
|
0.01
|
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5%
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7.4
|
1.25
|
0.313
|
1
|
0.1
|
0.01
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6%
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7.1
|
1.5
|
0.313
|
1
|
0.1
|
0.01
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1.3在凝膠模具中灌入凝膠溶液至玻璃闆頂端，插入梳子，避免産生(shēng)氣泡。
1.4靜(jìng)置20-60分(fēn)鍾，等待凝膠完全聚合。
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環境溫度
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凝固時間
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低于18度
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＞60分(fēn)鍾
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18度
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~40分(fēn)鍾
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25度
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~30分(fēn)鍾
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高于25度
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~20分(fēn)鍾
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注：凝膠的聚合時間與環境溫度有關。夏天溫度較高時，聚合較快(kuài)；冬天氣溫低時，聚合時間會延長。可(kě)以根據環境溫度的不同調節APS的加入量。
二、電泳：
2.1預電泳：拔出梳子，用0.5×TBE緩沖液徹底沖洗加樣孔2-3次。電泳槽内外加入适量0.5×TBE緩沖液，穩壓100 V預電泳10分(fēn)鍾。
注：試劑盒配套的5×TBE緩沖液僅夠配制凝膠用，0.5×TBE電泳緩沖液請(qǐng)自(zì)己制備，配方如(rú)下：
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終濃度
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順序
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原料
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1升
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5 升
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44.5 mM
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1
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Tris堿 [MW121.14]
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5.4 克
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27克
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1 mM
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2
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EDTA 2Na·2H2O [MW372.24]
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0.372 克
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1.86克
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44.5 MM
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3
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硼酸 [MW61.83]
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2.75 克
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13.75克
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4
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超純水最後定容至
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1 升
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5 升
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最後pH在8.2-8.3之間，可(kě)以不用調節pH，記錄每批pH
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2.2 把混合了無色上樣緩沖液的樣品加入到上樣孔内。在多餘的某個上樣孔内加入10 μl稀釋好的1X的EMSA 上樣緩沖液(藍色)，用于觀察電泳進行的情況。。
2.3 穩壓100 V電泳，可(kě)以冰浴或4度條件(jiàn)下電泳，确保膠的溫度不超過30℃。電泳至上樣緩沖液中的藍色染料溴酚藍至膠的下緣1/4處，停止電泳。