細胞凋亡-Hoechst 染色試劑盒

●  産品組成：

● 産品簡介：

Hoechst 33258也稱bisBenzimide H 33258或HOE 33258，分(fēn)子式爲C₂₅H₂₄N₆O·3HCl，分(fēn)子量爲533.88，CAS Number 23491-45-4。該染料是一種可(kě)以穿透細胞膜的藍色熒光(guāng)染料，對細胞的毒性較低，常用于細胞凋亡檢測，染色後可(kě)用熒光(guāng)顯微鏡觀察或流式細胞儀檢測。Hoechst 33258也用于普通的細胞核染色、DNA染色。

Hoechst 33258的最大(dà)激發波長爲346nm，最大(dà)發射波長爲460nm，與雙鏈DNA結合後，最大(dà)激發波長爲352nm， 最大(dà)發射波長爲461nm。

Hoechst染色試劑盒(Hoechst Staining Kit)爲您提供了一種經典而又快(kuài)速簡便的細胞凋亡檢測方法。細胞發生(shēng)凋亡時，染色質會固縮。所以Hoechst 33258染色後，在熒光(guāng)顯微鏡下觀察，正常細胞的細胞核呈正常的藍色，而凋亡細胞的細胞核會呈緻密濃染，或呈碎塊狀緻密濃染，顔色有些發白(bái)。

按照(zhào)每次使用0.5 ml染色液計(jì)算，該試劑盒可(kě)以使用100次。

● 貯存：

4℃避光(guāng)保存，一年(nián)有效。

● 操作(zuò)步驟：

一. 鐵壁細胞：

1.1 取潔淨蓋玻片在70%乙醇中浸泡5分(fēn)鍾或更長時間，無菌超淨台内吹幹或用無菌的PBS洗滌三遍，再用細胞培養液洗滌一遍。将蓋玻片置于六孔闆内，種入細胞培養過夜，生(shēng)長至50%-80%滿度。

1.2刺激細胞發生(shēng)凋亡後，吸盡培養液，加入0.5 ml固定液，固定10分(fēn)鍾或更長時間(可(kě)4℃過夜)。

1.3去(qù)盡固定液，用PBS洗兩遍，每次3分(fēn)鍾，吸盡液體(tǐ)。洗滌時宜用搖床或手動晃動。

1.4加入0.5 ml Hoechst 33258染色液，37℃避光(guāng)染色10-15分(fēn)鍾，手動晃動數次。

1.5去(qù)盡染色液，用PBS洗兩遍，每次3分(fēn)鍾，吸盡液體(tǐ)。洗滌時宜用搖床或手動晃動。

1.6滴一滴抗熒光(guāng)淬滅封片液于載玻片上，蓋上貼有細胞的蓋玻片，讓細胞接觸封片液，盡量避免氣泡。

1.7 熒光(guāng)顯微鏡使用紫外激發，可(kě)檢測到呈藍色的細胞核。激發波長350nm左右，發射波長460nm左右。

注：熒光(guāng)染料都(dōu)存在淬滅的問(wèn)題，建議(yì)染色後盡快(kuài)檢測。

二.懸浮細胞：

2.1 500 g（2400 rpm，下同）離(lí)心收集凋亡處理(lǐ)後細胞樣品于1.5 ml離(lí)心管内，加入0.5 ml固定液，緩緩懸起細胞，常溫固定10分(fēn)鍾或更長時間(可(kě)4℃過夜)。

2.2離(lí)心去(qù)盡固定液，用PBS洗兩遍，每次3分(fēn)鍾，洗滌期間手動晃動數次。

2.3 細胞沉澱中加入0.5 ml Hoechst 33258染色液，37℃避光(guāng)染色10-15分(fēn)鍾，手動晃動數次。

2.4 離(lí)心收集沉澱，重懸于100 μl PBS中。

2.5 取5 μl抗熒光(guāng)淬滅封片液于載玻片上，加入等體(tǐ)積步驟2.4染色後細胞重懸液，蓋上一潔淨的蓋玻片，盡量避免氣泡。

2.6 熒光(guāng)顯微鏡下紫外激發，可(kě)檢測到呈藍色的細胞核。激發波長350 nm左右，發射波長460 nm左右。

注：熒光(guāng)染料都(dōu)存在淬滅的問(wèn)題，建議(yì)染色後盡快(kuài)檢測。

三 實驗示例

操作(zuò)流程：使用不同濃度星飽菌素（Staurosporine，STS）凋亡處理(lǐ)Jurkat細胞。調整細胞密度爲1×10⁶/ml，每孔2 ml接種于六孔闆中；加入終濃度爲0，0.1，0.5，1，2，4 μM STS，37℃ 5%CO₂培養3小時；500 g 3 min收集細胞；細胞沉澱中加入1 ml固定液，常溫固定10 min；1×PBS漂洗兩次；細胞沉澱中加入0.5 ml Hoechst 33258染色液，37℃避光(guāng)染色10 min；離(lí)心後細胞沉澱重懸于100 μl 1×PBS中；取5 μl細胞懸液滴于載玻片上，加5 μl 抗熒光(guāng)淬滅劑，封片觀察。