細胞凋亡與壞死檢測試劑盒

●  産品組成：

● 産品簡介：

細胞凋亡與壞死檢測試劑盒(Apoptosis and Necrosis Assay Kit)可(kě)以快(kuài)速檢測細胞凋亡與細胞壞死。本試劑盒采用Hoechst 33342和碘化丙啶(Propidium Iodide，PI)雙染的方法。細胞發生(shēng)凋亡時，染色質會固縮。Hoechst 33342可(kě)以穿透細胞膜，染色後凋亡細胞熒光(guāng)會比正常細胞明顯增強。碘化丙啶(PI)不能穿透細胞膜，對于具有完整細胞膜的正常細胞或凋亡細胞不能染色。而對于壞死細胞，其細胞膜的完整性喪失，碘化丙啶(PI)可(kě)以染色壞死細胞。上述兩種染料雙染後，使用流式細胞儀或熒光(guāng)顯微鏡檢測時，正常細胞爲弱紅(hóng)色熒光(guāng)＋弱藍色熒光(guāng)，凋亡細胞爲弱紅(hóng)色熒光(guāng)＋強藍色熒光(guāng)，壞死細胞爲強紅(hóng)色熒光(guāng)＋強藍色熒光(guāng)。

按照(zhào)每個樣品細胞數量100萬計(jì)算，該試劑盒可(kě)以使用100次。

● 貯存：

避光(guāng)按照(zhào)标簽溫度保存，一年(nián)有效。

● 操作(zuò)步驟：

一. 貼壁細胞：

1.1在培養液中（細胞數量控制在10⁶以内）均勻滴加适量的Hoechst 33342染色液和PI染色液，輕柔混勻。例如(rú)對于十二孔闆中培養的貼壁細胞，每孔有1 ml的培養液，每孔需要加入5 μl Hoechst 33342染色液和5 μl PI染色液。培養液中的血清、酚紅(hóng)等都(dōu)不會對染色産生(shēng)幹擾。

1.2混勻，37℃培養15分(fēn)鍾，直接在顯微鏡下觀察；如(rú)果考慮到液體(tǐ)對拍(pāi)照(zhào)的乙酰個，可(kě)以吸除含染料的培養液，用染色緩沖液洗滌2-3次即可(kě)在熒光(guāng)顯微鏡下觀察。

注：爲避免凋亡細胞随培養液或染色緩沖液被吸除，在吸除液體(tǐ)前，對于用多孔闆中培養的細胞，最好用多孔闆離(lí)心機(jī)離(lí)心一下以充分(fēn)沉澱那些已經漂浮起來(lái)的凋亡細胞。

二. 懸浮細胞：

2.1 在懸浮細胞培養液中加入适量的Hoechst 33342染色液和PI染色液，輕柔混勻。例如(rú)對于十二孔闆中培養的懸浮細胞，每孔有1 ml的培養液，每孔需要加入5 μl Hoechst 33342染色液和5 μl PI染色液。培養液中的血清、酚紅(hóng)等都(dōu)不會對染色産生(shēng)幹擾。

2.2混勻，37℃培養15分(fēn)鍾，将細胞轉移到1.5 ml離(lí)心管中，500 g 離(lí)心5分(fēn)鍾收集細胞。

2.3細胞沉澱用細胞染色緩沖液洗兩遍，每次3分(fēn)鍾，吸盡液體(tǐ)。洗滌時宜用搖床或手動晃動。

2.4細胞沉澱中加入100 μl 細胞染色緩沖液，重懸沉澱。

2.5取5 μl抗熒光(guāng)淬滅封片液于載玻片上，加入等體(tǐ)積步驟2.4染色後細胞重懸液，蓋上一潔淨的蓋玻片，盡量避免氣泡。

2.6 熒光(guāng)顯微鏡下觀察。

注：熒光(guāng)染料都(dōu)存在淬滅的問(wèn)題，建議(yì)染色後盡快(kuài)檢測。

實驗示例：

293 細胞Hoechst/PI雙染檢測

 操作(zuò)程序：293細胞胰酶消化後調整細胞密度爲1×10⁵/ml。接種到12孔闆，1ml每孔，37度5%二氧化碳培養40小時，加入5 μl Hoechst 33342染色液和5 μl 碘化丙啶染色液，37度培養15分(fēn)鍾，熒光(guāng)顯微鏡觀察（40×）。