細胞膜紅(hóng)色熒光(guāng)染色試劑盒（DiI）

● 産品介紹：

細胞膜紅(hóng)色熒光(guāng)染色試劑盒(DiI)，Cell Plasma Membrane Staining Kit with DiI (Red Fluorescence)是一種以DiI爲熒光(guāng)探針，能夠快(kuài)速靈敏地對細胞膜進行紅(hóng)色熒光(guāng)染色标記的試劑盒。

DiI在進入細胞膜之前熒光(guāng)非常弱，僅當進入到細胞膜後才可(kě)以被激發出很強的熒光(guāng)。DiI被激發後可(kě)以發出橙紅(hóng)色的熒光(guāng)，DiI和磷酯雙層膜結合後的激發光(guāng)譜和發射光(guāng)譜參考上圖。其中，最大(dà)激發波長爲549nm，最大(dà)發射波長爲565nm。

本試劑盒如(rú)果用于流式細胞儀，每個樣品的檢測體(tǐ)系體(tǐ)積爲0.5 ml時，可(kě)以進行200次檢測；96孔闆每孔檢測體(tǐ)系的體(tǐ)積爲100 μl時可(kě)以進行1000次檢測。

● 産品組成：

● 貯存：

DiI（400×） -20℃避光(guāng)保存，一年(nián)有效。染色緩沖液可(kě)以4℃貯存。

● 使用說(shuō)明：

1. 細胞膜染色工(gōng)作(zuò)液制備：

細胞膜染色工(gōng)作(zuò)液的用量：對于6、12、24、96孔闆，每孔的細胞膜染色工(gōng)作(zuò)液分(fēn)别爲1~2ml、0.5~1ml、300~500μl和50~100μl；對于流式細胞樣品，每個樣品的細胞膜染色工(gōng)作(zuò)液爲0.5ml；對于切片，可(kě)以根據切片大(dà)小，每個切片使用100-200μl的細胞膜染色工(gōng)作(zuò)液。

注：不同細胞的最佳染色濃度略有不同，細胞膜染色工(gōng)作(zuò)液的最終濃度建議(yì)根據不同細胞系和實驗體(tǐ)系進行優化，可(kě)在1:100-1:400之間進行調整。

2. 懸浮活細胞染色：

2.1 加入适當體(tǐ)積的細胞膜染色工(gōng)作(zuò)液重懸細胞，使其密度爲1×10⁶/ml左右。

2.2 37℃避光(guāng)孵育細胞5-20 min，不同的細胞最佳孵育時間不同。以5 min作(zuò)爲初始孵育時間，根據實際所用的細胞優化染色時間，以得(de)到最佳的熒光(guāng)染色效果。

2.3 500×g常溫離(lí)心5 min。

2.4 吸除上清液，緩慢(màn)加入37℃預熱(rè)的細胞培養液重懸細胞。

2.5 用細胞培養重複漂洗沉澱一次。

2.6 流式細胞儀檢測，或将細胞封片觀察，封片時請(qǐng)避免使用含有甘油或其它有機(jī)物的封片劑，否則會影(yǐng)響染色并增加熒光(guāng)背景，可(kě)以直接用PBS封片，在熒光(guāng)顯微鏡下觀察。

3. 貼壁活細胞染色：

3.1 将貼壁細胞種于細胞培養皿、多孔細胞培養闆或者細胞爬片上。

3.2 吸除細胞培養液，用PBS洗滌細胞2次。

3.3 加入适當體(tǐ)積的細胞膜染色工(gōng)作(zuò)液，輕輕晃動使染料均勻覆蓋所有細胞。

3.4 37℃避光(guāng)孵育細胞5-20 min，不同的細胞最佳培養時間不同。以5min作(zuò)爲初始孵育時間，根據實際所用的細胞優化染色時間，以得(de)到最佳的熒光(guāng)染色效果。

3.5 吸除細胞膜染色工(gōng)作(zuò)液，用PBS洗滌2次，然後加入37℃預熱(rè)的細胞培養液即可(kě)在熒光(guāng)顯微鏡下觀察。

4. 固定後細胞或切片的染色：

注：DiI不建議(yì)用于固定後細胞或組織的染色，因爲細胞固定後影(yǐng)響了細胞膜的結構，不能準确反映熒光(guāng)标記位置。以下步驟僅供參考：

4.1. 使用4%多聚甲醛固定液進行固定。

4.2 吸除固定液，用PBS洗滌細胞3遍。

4.3 使用配制在PBS中的0.1% Triton X-100進行通透，常溫10 min。然後用PBS洗滌細胞3遍。

4.4按照(zhào)免疫染色的方法進行抗體(tǐ)的孵育或用其它染料進行染色。注意：抗體(tǐ)孵育步驟中的封閉液、抗體(tǐ)稀釋液及洗滌液不能含有去(qù)垢劑。

4.5加入适當體(tǐ)積的細胞膜染色工(gōng)作(zuò)液，輕輕晃動使染料均勻覆蓋所有細胞或樣品。

4.6 37℃避光(guāng)孵育5-20 min，最佳染色時間需要根據自(zì)己的實驗條件(jiàn)摸索，以達到最佳的熒光(guāng)染色效果。

4.7吸除細胞膜染色工(gōng)作(zuò)液，用PBS洗滌2-3次，随後即可(kě)在熒光(guāng)顯微鏡下觀察。

● 實驗示例：

操作(zuò)程序：293細胞調整密度1×10⁵/ml，接種到6孔闆中，培養30小時；去(qù)除培養基，PBS漂洗一次；33342染色37度10分(fēn)鍾，去(qù)除33342染色液，加1.5 ml PBS，觀察拍(pāi)照(zhào)（40×）（圖A）；去(qù)除PBS，DiI染色，37度10分(fēn)鍾，去(qù)除DiI染色液，加1.5ml PBS，觀察拍(pāi)照(zhào)（40×）（圖B）