AnnexinV-FITC/PI細胞凋亡檢測試劑盒
AnnexinV-FITC/PI Apoptosis Detection Kit
● 産品組成：
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貨号
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名稱
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規格
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FP2050M
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AnnexinV-FITC/PI細胞凋亡檢測試劑盒
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50次
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● 産品簡介：
在正常細胞中，磷脂酰絲氨酸（PS）隻分(fēn)布在細胞膜脂質雙層的内側，而在細胞凋亡早期，細胞膜中的磷脂酰絲氨酸（PS）由脂膜内側翻向外側。Annexin V 是一種分(fēn)子量爲35～36kD 的Ca2+依賴性磷脂結合蛋白(bái)，與磷脂酰絲氨酸有高度親和力，故可(kě)通過細胞外側暴露的磷脂酰絲氨酸與凋亡早期細胞的胞膜結合。因此Annexin V被作(zuò)爲檢測細胞早期凋亡的靈敏指标之一。将Annexin V 進行熒光(guāng)素FITC 标記，以标記了的Annexin V 作(zuò)爲熒光(guāng)探針，利用熒光(guāng)顯微鏡或流式細胞儀可(kě)檢測細胞凋亡的發生(shēng)。碘化丙啶（Propidium Iodide, PI）是一種核酸染料，它不能透過完整的細胞膜，但(dàn)對凋亡中晚期的細胞和死細胞，PI 能夠透過細胞膜而使細胞核染紅(hóng)。因此将Annexin V 與PI 匹配使用，就(jiù)可(kě)以将處于不同凋亡時期的細胞區分(fēn)開來(lái)。
以每次使用5 μl Annexin V-FITC計(jì)算，本試劑盒FP2050M可(kě)以檢測50個樣品。
● 包裝組份：
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産品編号
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産品名稱
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規格
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FP2050M-1
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Annexin V-FITC
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250 μl
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FP2050M-2
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Annexin V-FITC結合液
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30 ml
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FP2050M-3
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碘化丙啶染色液
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250 μl
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● 保存條件(jiàn)：
4oC保存，一年(nián)有效。Annexin V-FITC和碘化丙啶染色液需要避光(guāng)保存。
● 操作(zuò)步驟：
一. 懸浮細胞操作(zuò)流程：
1.1 誘導凋亡的操作(zuò)步驟 (以Jurkat細胞爲例)：
1.1.1 制備1×106個/ml 的Jurkat細胞懸液。
1.1.2 加入終濃度爲1 μM 的凋亡誘導劑 (STS，Staurosuporine，星孢菌素)。
1.1.3 在37℃培養箱培養3 h。
注：1 μM Staurosuporine用于誘導Jurkat cell凋亡。最佳誘導條件(jiàn)請(qǐng)根據實驗的細胞類型與誘導劑調整。
1.2 Annexin V染色操作(zuò)步驟：
1.2.1 将細胞懸液轉移到離(lí)心管中，500 g（2500 rpm）離(lí)心3 min，去(qù)除上清液。
1.2.3沉澱中加入PBS，500 g（2500 rpm）離(lí)心 3 min，去(qù)除上清液。重複漂洗一次。
1.2.4加入Annexin V-FITC結合液，制成終濃度爲1×106 個/ml的細胞懸液。
注：加入結合液的體(tǐ)積根據實驗目的自(zì)行調整，一般推薦不少于500 μl。
1.2.5 取100 μl步驟1.2.4中制備的細胞懸液，加入到一個新的離(lí)心管中。
1.2.6 向細胞懸液中加入5 μl Annexin V-FITC，再加入5 μl 碘化丙啶染色液。
1.2.7 常溫下避光(guāng)放(fàng)置15 min，即爲待檢液。
1.3 結果檢測：
1.3.1 流式細胞儀檢測：
步驟1.2.7中的待檢液中加入400 μl Annexin
V-FITC結合液。激發波長Ex = 488 nm；發射波長Em = 530 nm。Annexin V-FITC的綠色熒光(guāng)通過FITC通道 (FL1) 檢測；PI的紅(hóng)色熒光(guāng)通過PI 通道 (FL2或FL3) 檢測。注：熒光(guāng)染料都(dōu)存在淬滅的問(wèn)題，建議(yì)1小時内完成檢測。
1.3.2 熒光(guāng)顯微鏡檢測：
取步驟1.2.7的待檢液5 μl滴于載玻片上，加5μl 抗熒光(guāng)淬滅封片液，封片觀察。
注：熒光(guāng)染料都(dōu)存在淬滅的問(wèn)題，建議(yì)染色後盡快(kuài)檢測。
二. 懸浮細胞操作(zuò)流程：
2.1 誘導凋亡的操作(zuò)步驟 (以Caco-2細胞爲例)：
2.1.1 制備1×106個/ml 的Caco-2細胞懸液，将細胞懸液接種到培養皿或者培養闆中。
2.1.2 在37℃ 5% CO2培養箱中預培養。
2.1.3加入終濃度爲25 μM的凋亡誘導劑 (Cisplatin，順鉑)。
2.1.4 在37℃5% CO2培養箱中培養4 days。
2.2 Annexin V染色操作(zuò)步驟：
2.2.1吸出細胞培養液至離(lí)心管中待用，細胞用PBS洗滌，加入适量不含EDTA的胰酶細胞消化液消化細胞。
2.2.2 常溫孵育至輕輕吹打可(kě)以使貼壁細胞吹打下來(lái)時，吸除胰酶細胞消化液。需避免胰酶的過度消化。
2.2.3加入步驟2.2.1中收集的細胞培養液，稍混勻，轉移到離(lí)心管内，2000 rpm
5 min，小心吸除上清。
注意：加入的細胞培養液一方面可(kě)以收集已經懸浮的發生(shēng)凋亡或壞死的細胞，另一方面細胞培養液中的血清可(kě)以有效抑制或中和殘留的胰酶；殘留的胰酶會消化并降解後續加入的Annexin V-FITC導緻染色失敗。
2.2.4 細胞沉澱中加入預冷(lěng)PBS輕輕重懸細胞，2000 rpm 5
min，小心吸除上清；重複洗滌一次。
2.2.5細胞沉澱中加入适量Annexin V-FITC結合液，制成終濃度爲1×106 個/ml的細胞懸液。
注：加入結合液的體(tǐ)積根據實驗目的自(zì)行調整，一般推薦不少于500 μl。
2.2.6 取100 μl步驟2.2.5中制備的細胞懸液，加入到一個新的離(lí)心管中。
2.2.7 向細胞懸液中加入5 μl Annexin V-FITC，再加入5 μl 碘化丙啶染色液。
2.2.8 常溫下避光(guāng)放(fàng)置15 min，即爲待檢液。
2.3 結果檢測：
2.3.1 流式細胞儀檢測：
步驟2.2.8中的待檢液中加入400 μl Annexin
V-FITC結合液。激發波長Ex = 488 nm；發射波長Em = 530 nm。Annexin V-FITC的綠色熒光(guāng)通過FITC通道 (FL1) 檢測；PI的紅(hóng)色熒光(guāng)通過PI 通道 (FL2或FL3) 檢測。注：熒光(guāng)染料都(dōu)存在淬滅的問(wèn)題，建議(yì)1小時内完成檢測。
2.3.2 熒光(guāng)顯微鏡檢測：
取步驟2.2.8的待檢液5 μl滴于載玻片上，加5μl 抗熒光(guāng)淬滅封片液，封片觀察。
檢測程序：
Jurkat細胞調整到1×106/ml，6孔闆接種2 ml；凋亡處理(lǐ)加10 μl 0.2 M STS（星型飽菌素），終濃度爲1 μM；37度 5%二氧化碳培養3小時；2 ml收集，PBS漂洗2次，重懸于300 μl 結合液中；調整細胞密度爲1×106/ml制成細胞懸液。取100 μl細胞懸液加5 μl Annexin V-FITC，5 μl 碘化丙啶染色液，RT 避光(guāng)靜(jìng)置15min，取5 μl加5 μl封片液，封片觀察。FITC（+）PI（+）爲凋亡晚期細胞（40×）。
● 注意事(shì)項：
1. 本試劑盒适用于檢測活細胞，流式細胞儀檢測時，細胞數量不應低于1×106，不推薦用于檢測組織樣本。
2. 推薦使用懸浮培養細胞。如(rú)果是貼壁細胞，需用不含 EDTA
的胰酶消化，如(rú)消化不當，可(kě)能引起假陽性，而用細胞刮子會造成細胞粘連成團，而影(yǐng)響檢測。
3. 細胞固定後可(kě)能導緻熒光(guāng)的淬滅，請(qǐng)不要固定樣品。
4. 消化貼壁細胞殘留的胰酶會消化并降解Annexin
V-FITC，最終導緻染色失敗。
5 .因檢測細胞的類型、凋亡誘導劑種類、使用的檢測儀器不同，因而流式檢測的熒光(guāng)補償也不同，因此建議(yì)每次檢測均需使用未經凋亡誘導處理(lǐ)的細胞作(zuò)爲對照(zhào)，進行熒光(guāng)補償的調節。