Hochest 33342活細胞染色液（100×）

Hoechst 33342 Staining Solution for Live Cells(100×)

●  産品組成：

● 産品簡介：

Hoechst 33342，也稱bisBenzimide H 33342 或HOE 33342，分(fēn)子式爲C₂₇H₂₈N₆O·3HCl ，分(fēn)子量MW561.93，CAS: 23491-52-3，是一種可(kě)以穿透細胞膜的藍色熒光(guāng)染料，對細胞的毒性較低。Hoechst 33342 專一性地與雙鏈DNA結合（優先結合AT），常用于細胞核染色。染色後可(kě)以用熒光(guāng)顯微鏡觀察或流式細胞儀檢測。Hoechst 33342 的最大(dà)激發波長爲346 nm（紫外激發），最大(dà)發射波長爲460nm（藍色熒光(guāng)）；Hoechst 33342 和雙鏈DNA 結合後，最大(dà)激發波長爲350nm，最大(dà)發射波長爲461nm。另外，由于Hoechst 33342專一性結合DNA，不與RNA結合，樣品無需使用RNase處理(lǐ)。與DAPI相(xiàng)比，Hoechst 33342具有更好的膜通透性，更适合于活細胞的染色。

Hoechst 33342和Hoechst 33258相(xiàng)比，Hoechst 33342對細胞的毒性作(zuò)用更小一些，33258穿透能力較33342弱，染活細胞時容易被"泵出"，也就(jiù)是拒染。所以一般來(lái)說(shuō)Hoechst 33258用于細胞固定後再染色，而Hoechst33342則可(kě)以對活細胞直接進行染色。

本染色液爲100×濃度，使用終濃度爲1×，可(kě)直接用于活細胞或組織的細胞核染色，也可(kě)稀釋後用于固定細胞或組織的細胞核染色。

● 貯存：

-20℃避光(guāng)保存，一年(nián)有效。

● 操作(zuò)步驟：

一. 活細胞染色：

1.1 貼壁細胞：

1.1.1在培養液中均勻滴加适量的Hoechst 33342活細胞染色液(100×)至終濃度爲1×，輕柔混勻。例如(rú)對于十二孔闆中培養的貼壁細胞，每孔有1 ml的培養液，每孔需要加入10 μl Hoechst 33342活細胞染色液(100×)。培養液中的血清、酚紅(hóng)等都(dōu)不會對染色産生(shēng)幹擾。

1.1.2在适宜于細胞培養的溫度孵育10分(fēn)鍾，可(kě)以直接在熒光(guāng)顯微鏡下觀察。如(rú)果考慮到培養液對觀察效果的影(yǐng)響，進行以下操作(zuò)步驟。

1.1.3吸除含染料的培養液，用PBS洗滌2-3次即可(kě)在熒光(guāng)顯微鏡下觀察。

注：爲避免凋亡細胞随培養液或PBS被吸除，在吸除液體(tǐ)前，對于用多孔闆中培養的細胞，最好用多孔闆離(lí)心機(jī)離(lí)心一下以充分(fēn)沉澱那些已經漂浮起來(lái)的凋亡細胞。細胞發生(shēng)凋亡時，會看(kàn)到凋亡細胞的細胞核呈緻密濃染，或呈碎塊狀緻密濃染。

1.2. 懸浮細胞：

1.2.1 在懸浮細胞培養液中加入适量的Hoechst 33342活細胞染色液(100×)至終濃度爲1×，輕柔混勻。例如(rú)對于12孔闆中培養的貼壁細胞，每孔有1 ml的培養液，每孔需要加入10 μl Hoechst 33342活細胞染色液(100×)。培養液中的血清、酚紅(hóng)等都(dōu)不會對染色産生(shēng)幹擾。

1.2.2 在适宜于細胞培養的溫度孵育10分(fēn)鍾，可(kě)以直接在熒光(guāng)顯微鏡下觀察。如(rú)果考慮到培養液對觀察效果的影(yǐng)響，進行以下操作(zuò)步驟。

1.2.3将細胞轉移到1.5 ml離(lí)心管中，500 g 離(lí)心5分(fēn)鍾收集細胞。細胞沉澱用PBS洗兩遍，每次3分(fēn)鍾，吸盡液體(tǐ)。

1.2.4細胞沉澱中加入100-200 μl PBS，重懸沉澱。

1.2.6取5 μl抗熒光(guāng)淬滅封片液于載玻片上，加入等體(tǐ)積步驟1.2.4染色後細胞重懸液，蓋上一潔淨的蓋玻片，盡量避免氣泡。

1.2.6 熒光(guāng)顯微鏡使用紫外激發，可(kě)檢測到呈藍色的細胞核。激發波長350nm左右，發射波長460nm左右。

染色程序：

 Jurkat細胞密度調整到1×10⁶/ml，六孔闆接種2 ml，加入10 μl STS（星孢菌素）至終濃度1 μM

 37度培養3小時；加入20 μl Hochest 33342活細胞染色液（100×），RT避光(guāng)染色15分(fēn)鍾，熒光(guāng)顯微鏡直接觀察。左圖爲正常細胞（10×），右圖爲STS誘導凋亡的細胞（10×）。

染色程序：

 293細胞消化後調整密度爲1×10⁵/ml；12孔闆，每孔接種1 ml，37度培養30小時；加入10 μl Hochest 33342活細胞染色液（100×）；37度培養10分(fēn)鍾，直接觀察。