Percoll不連續密度梯度沉澱法分(fēn)離(lí)純化淋巴細胞和淋巴母細胞

(一) 原理(lǐ)

Percoll是一種包有乙烯吡咯烷酮的矽膠顆粒。滲透壓很低(<20mosm／kg H２O), 粘度也很小，可(kě)形成高達1.3g／ml密度，采用預先形成的密度梯度時可(kě)在低離(lí)心力(200～1000g)于數分(fēn)至數十分(fēn)鍾内達到滿意的細胞分(fēn)離(lí)結果。由于Percoll擴散常數低，所形成的梯度十分(fēn)穩定。此外，Percoll不穿透生(shēng)物膜，對細胞無毒害，因此廣泛用于分(fēn)離(lí)細胞、亞細胞成分(fēn)、細菌及病毒，還(hái)可(kě)将受損細胞及其碎片與完好的活細胞分(fēn)離(lí)。

二)操作(zuò)方法及注意事(shì)項
1.不同濃度(密度)Percoll溶液的制備: 先用9份Percoll與1份8.5％ NaCl或1.5MPBS混合達到生(shēng)理(lǐ)性滲透壓，然後用生(shēng)理(lǐ)溶液(0.85％ NaCl或0.15M PBS)稀釋到所需濃度。
Percoll濃度(％) 70 60 50 40 30 20
比重g／ml   1.090     1.077     1.067     1.056     1.043       1.031

2.不連續密度梯度Percoll層的制備: 先将試管壁用牛血清濕潤，除去(qù)多餘血清，這種預處理(lǐ)可(kě)使逐層疊加的Percoll液平穩沿管壁流下，使形成滿意的界面。在制備過程中一般用長針頭注射器從(cóng)高密度向低密度逐層放(fàng)置，有時相(xiàng)鄰兩層Percoll比重相(xiàng)差不大(dà)時，可(kě)将Percoll液放(fàng)入注射器中，小針頭斜面緊貼管壁，任其自(zì)然慢(màn)慢(màn)流下。
    3.裝樣：樣品體(tǐ)積和細胞濃度根據不同細胞而異，一般加樣體(tǐ)積不宜過大(dà)，細胞濃度也不可(kě)過高，否則會影(yǐng)響細胞的分(fēn)離(lí)和回收。
    4.離(lí)心：一般采用離(lí)心力爲400g，時間20～25min。由于多層Percoll之間密度差别不大(dà)，因此離(lí)心機(jī)加速、降速時要慢(màn)，要平穩。
    5.取樣：當所要分(fēn)離(lí)的細胞絕大(dà)部分(fēn)在兩層的界面時，可(kě)逐層去(qù)除Percoll液後收集界面部位的細胞;有時大(dà)部分(fēn)細胞位于Percoll層中,則需要逐層收集。收獲含有Percoll液的細胞經2次洗滌後可(kě)供培養或檢測用。
(三)分(fēn)離(lí)純化細胞舉例
1.富含NK活性大(dà)顆粒淋巴細胞(LGL)的純化:按順序由下向上逐層加50％、47.5％、45％、42.5％和40％五種不同密度的Percoll,如(rú)用10ml試管(或塑料管)分(fēn)離(lí),每層Percoll約1.2～1.5ml，初步從(cóng)外周血中分(fēn)離(lí)的PBMC細胞1×10８懸于１ml培基中，按要求裝樣、離(lí)心和取樣。一般富含NK殺傷活性的LGL細胞位于42.5％與45％Percoll界面以及上下二層的Percoll液中。
    2.純化淋巴母細胞和除去(qù)死細胞：分(fēn)别疊加50％和30％Percoll液。收取經PHA(或其它抗原、有絲分(fēn)裂原)刺激PBMC,或含有較高比例異型的PBMC(如(rú)腎綜合征出血熱(rè)患者)，按要求裝樣、離(lí)心和取樣。位于管底的淋巴細胞爲小淋巴細胞；兩層Percoll之間爲淋巴母細胞，純度和回收率在80％以上，位于30％Percoll表面是死細胞。收獲淋巴母細胞可(kě)進行表型、結構以及功能的研究。

(四) 人(rén)不同血細胞的漂浮密度
表   人(rén)不同血細胞的漂浮密度
──────────────┬──────────────────
細 胞   漂浮密度    │ 細 胞       漂浮密度
──────────────┼──────────────────
紅(hóng)細胞 1.09-1.11 │淋巴細胞 1.052-1.077
粒細胞  │ B淋巴細胞 1.062-1.075
嗜酸性 1.09-1.095  │ T淋巴細胞 1.065-1.077
嗜中性 1.080-1.085 │ 淋巴母細胞 1.065-1.077
單核細胞 1.050-1.066 │自(zì)然殺傷細胞 1.050-1.070
血小闆 1.030-1.060 │
──────────────┴──────────────────