植物脯氨酸檢測試劑盒(茚三酮比色法)
Plant
Proline Assay Kit with Ninhydrin
● 産品組成：
|
組分(fēn)貨号
|
名稱
|
規格
|
貯存
|
|
PP5040-01
|
試劑1-Pro裂解液
|
125 ml
|
RT
|
|
PP5040-02
|
試劑2-Pro标準液
|
1 ml
|
4℃
|
|
PP5040-03
|
試劑3-Pro顯色液
|
50 ml
|
4℃ 避光(guāng)
|
● 産品簡介：
脯氨酸(Proline，Pro)是一種環狀的α-亞氨基酸，呈中性，等電點爲6.30，易溶于水。在正常環境情況下脯氨酸含量較低，但(dàn)在逆境下(旱、熱(rè)、冷(lěng)、凍、鹽堿等)，脯氨酸常有明顯積累，即積累指數與植物的抗逆性有關。植物脯氨酸檢測試劑盒(茚三酮比色法)檢測原理(lǐ)是脯氨酸與茚三酮共熱(rè)發生(shēng)反應，能産生(shēng)穩定的紅(hóng)色産物，以分(fēn)光(guāng)光(guāng)度計(jì)測定處吸光(guāng)度，在一定範圍内顔色深淺(即吸光(guāng)度)與脯氨酸濃度成正比。
該試劑盒不使用甲苯等有害溶劑，經濟環保。
該試劑盒主要用于測定植物組織中的遊離(lí)脯氨酸含量，不适用于動物及醫療樣品中脯氨酸的測定。
按照(zhào)一次使用1 ml Pro顯色液計(jì)算，試劑盒可(kě)以使用50次。
● 自(zì)備材料：
植物根莖、葉子等；剪刀；螺蓋離(lí)心管或鎖蓋離(lí)心管或96孔闆；1ml玻璃比色皿；分(fēn)光(guāng)光(guāng)度計(jì)或酶标儀；水浴鍋或幹浴器；離(lí)心機(jī)
● 操作(zuò)步驟：
1、 樣本處理(lǐ)：
取新鮮植物組織，清洗幹淨，擦幹，剪碎，迅速稱取， 按照(zhào)20mg重量加入1ml Pro裂解液（注意是否已經加入無水乙醇）的比例加入Pro裂解液（建議(yì)使用1.5ml螺口離(lí)心管或鎖蓋離(lí)心管），沸水浴或幹浴處理(lǐ)20分(fēn)鍾 (期間間歇混勻)，10000 rpm離(lí)心 2分(fēn)鍾，上清即爲脯氨酸提取液，4℃保存備用。待測提取液如(rú)不能及時測定，應置于-20℃保存，1-2天内穩定。
2、 配制系列脯氨酸标準溶液：
取1ml 試劑1-Pro裂解液全部加入到試劑2-Pro标準液的小管中，混勻後徹底溶解，即配成的Pro标準液（100mg/ml）。
取1 μl 100mg/ml 标準液加入到1ml Pro裂解液中，即配成100μg/ml Pro标準液待用。參照(zhào)下表配制1-6号不同濃度的Pro标準溶液。
|
編号
|
1
|
2
|
3
|
4
|
5
|
6
|
7
|
8
|
|
100μg/ml Pro标準液加入量（ml）
|
0.01
|
0.02
|
0.04
|
0.06
|
0.08
|
0.10
|
0.15
|
0.2
|
|
Pro裂解液（ml）
|
0.49
|
0.48
|
0.46
|
0.44
|
0.42
|
0.4
|
0.35
|
0.3
|
|
脯氨酸含量（μg）
|
1
|
2
|
4
|
6
|
8
|
10
|
15
|
20
|
4、 樣品測定:
=
1 \* GB3 ① 分(fēn)光(guāng)光(guāng)度計(jì)測定：參考下表設置反應混合液，依次加入試劑：
|
編号
|
0
|
1-8
|
9-X
|
|
|
空白(bái)管
|
标準管
|
測定管
|
|
試劑1-Pro裂解液
|
0.5 ml
|
-
|
-
|
|
步驟1中的脯氨酸提取液
|
-
|
-
|
0.5 ml
|
|
Pro标準液（步驟3中1-8管）
|
-
|
0.5 ml
|
-
|
|
試劑3-Pro顯色液
|
1 ml
|
1 ml
|
1 ml
|
③ 水浴煮沸或幹浴20分(fēn)鍾，間歇混勻。加熱(rè)時務必注意避免液體(tǐ)暴沸濺出，可(kě)使用鎖蓋離(lí)心管或螺旋蓋離(lí)心管。
④ 冰浴或流水冷(lěng)卻至室溫，10000 rpm離(lí)心 2分(fēn)鍾，如(rú)發現沒有不溶物，也可(kě)以不離(lí)心。
⑤ 取上清，用空白(bái)管作(zuò)爲對照(zhào)，取1ml反應混合液用分(fēn)光(guāng)光(guāng)度計(jì)測定520nm吸光(guāng)度值。
=
6 \* GB3 ⑥ 酶标儀測定：參考下表設置反應混合液，依次加入試劑：
|
|
空白(bái)管
|
标準管
|
測定管
|
|
試劑1-Pro裂解液
|
50 μl
|
-
|
-
|
|
步驟1中的脯氨酸提取液
|
-
|
-
|
50 μl
|
|
Pro标準液（步驟3中1-8管）
|
-
|
50 μl
|
-
|
|
試劑3-Pro顯色液
|
100 μl
|
100 μl
|
100 μl
|
5、 計(jì)算：
以系列脯氨酸标準(1-8号管)含量(μg)爲橫坐(zuò)标，以對應的吸光(guāng)度爲縱坐(zuò)标，制作(zuò)标準曲線，根據測定管的吸光(guāng)度進而計(jì)算其脯氨酸含量。
如(rú)使用分(fēn)光(guāng)光(guāng)度計(jì)測定，根據如(rú)下公式計(jì)算具體(tǐ)樣品中脯氨酸的含量：
植物組織樣品脯氨酸含量(μg/g)=1.5（C×VT）/(W×VS) =3C/W
VT=步驟1中脯氨酸提取液總體(tǐ)積(ml)，此處爲1ml
W=步驟1中使用的樣品鮮重(g)
VS=步驟4中測定時加入的脯氨酸提取液體(tǐ)積(ml)，本實驗爲0.5ml
1.5系數爲步驟4中反應混合液體(tǐ)積爲1.5ml，取1ml測定吸光(guāng)值
