RIPA裂解液(強，不含抑制劑，不含螯合劑)

● 産品包裝：

● 産品簡介：

RIPA裂解液(RIPA  Lysis  Buffer)是一種傳統的細胞組織快(kuài)速裂解液。RIPA裂解液裂解得(de)到的蛋白(bái)樣品可(kě)以用于常規的Western、IP等。RIPA的本意是Radio  Immunoprecipitation  Assay。RIPA裂解液的配方有很多種，根據其裂解液的強度大(dà)緻可(kě)以分(fēn)爲強、中、弱三類。該RIPA裂解液(強)的主要成分(fēn)爲50 mM Tris (pH 7.4)，150 mM NaCl，1% Triton X-100，1% sodium deoxycholate，0.1% SDS，不含蛋白(bái)酶抑制劑，不含磷酸酶抑制劑，不含螯合劑如(rú)EDTA或EGTA，可(kě)适用于明膠酶譜實驗的蛋白(bái)提取。使用前根據實驗需要添加蛋白(bái)酶抑制劑或磷酸酶抑制劑以及EDTA或EGTA。

用該RIPA裂解液裂解得(de)到的蛋白(bái)樣品，可(kě)以用BCA蛋白(bái)濃度測定試劑盒測定蛋白(bái)濃度。由于含有較高濃度的去(qù)垢劑，不能用Bradford法測定蛋白(bái)濃度。

● 保存、效期及運輸：

-20℃保存，有效期一年(nián)，濕冰運輸。

● 注意事(shì)項：

1.爲取得(de)最佳的使用效果，盡量避免過多的反複凍融。可(kě)以适當分(fēn)裝後使用。需自(zì)備PMSF。裂解樣品的所有步驟都(dōu)需在冰上或4℃進行。

2. RIPA裂解液的裂解産物中經常會出現一小團透明膠狀物，屬常見(jiàn)現象。該透明膠狀物爲含有基因組DNA等的複合物。在不檢測與基因組DNA結合特别緊密的蛋白(bái)的情況下，可(kě)以直接離(lí)心取上清用于後續實驗；如(rú)果需要檢測和基因組結合特别緊密的蛋白(bái)，則可(kě)以通過超聲處理(lǐ)打碎打散該透明膠狀物，随後離(lí)心取上清用于後續實驗。如(rú)果檢測一些常見(jiàn)的轉錄因子，例如(rú)NF-kappaB、p53等時，通常不必進行超聲處理(lǐ)，就(jiù)可(kě)以檢測到這些轉錄因子。

● 使用說(shuō)明：

1.  準備RIPA裂解液：

融解RIPA裂解液，混勻；取适當量的裂解液，在使用前數分(fēn)鍾内加入1/100體(tǐ)積的100 mM PMSF，使PMSF的最終濃度爲1 mM。

注：進行明膠酶譜實驗提取蛋白(bái)樣品時，不要添加EDTA或EGTA，以免螯合掉MMP活性需要的二價陽離(lí)子；蛋白(bái)酶抑制劑也要選擇性添加，不要添加金屬蛋白(bái)酶抑制劑，可(kě)以添加PMSF（絲氨酸蛋白(bái)酶抑制劑）。

2. 細胞蛋白(bái)提取：

2.1 貼壁細胞：去(qù)除培養液，加入适量1×PBS，輕柔漂洗一遍，不要擾動貼壁細胞。按照(zhào)6孔闆每孔加入100-200 μl裂解液的比例加入裂解液，移液器吹打數下，使裂解液和細胞充分(fēn)接觸，冰上裂解細胞5分(fēn)鍾，用細胞刮刀刮下細胞收集于1.5 ml離(lí)心管中，冰上繼續裂解15分(fēn)鍾，間歇混勻。

2.2 懸浮細胞：450 g 4℃ 離(lí)心5 min收集細胞；用适量1×PBS重懸細胞，450 g 4℃ 離(lí)心5 min收集細胞；重複漂洗細胞一次；按照(zhào)細胞沉澱體(tǐ)積（PCV）20 μl加入200 μl RIPA的比例加入RIPA，混勻細胞沉澱，冰浴處理(lǐ)15分(fēn)鍾，間歇混勻。

注：2×10⁶ Jurkat細胞，其細胞沉澱體(tǐ)積（PCM，Packed Cell Volume）大(dà)約爲20 μl。

2.3 裂解細胞：

裂解混合物超聲波處理(lǐ)（超聲條件(jiàn)根據儀器調整，建議(yì)條件(jiàn)爲）；如(rú)沒有超聲破碎儀，可(kě)以使用注射器用27G針頭處理(lǐ)裂解物10-15次，以徹底裂解細胞。冰浴處理(lǐ)15分(fēn)鍾。

注：裂解中細胞會釋放(fàng)出變性的核酸，呈團狀粘稠透明樣，如(rú)不進行超聲或針頭裂解處理(lǐ)，會導緻裂解物非常粘稠，大(dà)大(dà)降低蛋白(bái)提取的得(de)率和純度。

2.4 離(lí)心收集上清：

充分(fēn)裂解後，4℃ 16000 g離(lí)心10分(fēn)鍾，取上清，即可(kě)進行後續的PAGE、Western和免疫沉澱等操作(zuò)。

3. 組織樣品蛋白(bái)提取：

3.1 手術(shù)切除的組織塊迅速置于預冷(lěng)的生(shēng)理(lǐ)鹽水中，漂洗數次，洗淨組織血迹，用濾紙吸

幹組織表面液體(tǐ)，将組織切成細小的碎片。

3.2 按照(zhào)每20 mg組織加入200 μl裂解液的比例加入裂解液。(如(rú)果裂解不充分(fēn)可(kě)以适當添加更多的裂解液，如(rú)果需要高濃度的蛋白(bái)樣品，可(kě)以适當減少裂解液的用量。)

3.3 用玻璃勻漿器冰浴勻漿5-10次，收集勻漿後的裂解混合物，超聲波處理(lǐ)（超聲條件(jiàn)根據儀器調整，建議(yì)條件(jiàn)爲）；如(rú)沒有超聲破碎儀，可(kě)以使用注射器用27G針頭處理(lǐ)裂解物10-15次，以徹底裂解細胞。裂解物冰浴處理(lǐ)15分(fēn)鍾。

注：裂解中細胞會釋放(fàng)出變性的核酸，呈團狀粘稠透明樣，如(rú)不進行超聲或針頭裂解處理(lǐ)，會導緻裂解物非常粘稠，大(dà)大(dà)降低蛋白(bái)提取的得(de)率和純度。

3.4 充分(fēn)裂解後，4℃ 16000 g離(lí)心10分(fēn)鍾，取上清，即可(kě)進行後續的PAGE、Western和免疫沉澱等操作(zuò)。