RIPA裂解液(強)
● 産品包裝:
産品編号
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産品名稱
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産品包裝
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說(shuō)明書(shū)
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RL1020
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RIPA裂解液(強)
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100 ml
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1份
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● 産品簡介:
RIPA裂解液(RIPA
Lysis Buffer)是一種傳統的細胞組織快(kuài)速裂解液。RIPA裂解液裂解得(de)到的蛋白(bái)樣品可(kě)以用于常規的Western、IP等。RIPA的本意是Radio Immunoprecipitation Assay。RIPA裂解液的配方有很多種,根據其裂解液的強度大(dà)緻可(kě)以分(fēn)爲強、中、弱三類。RIPA裂解液(強)的主要成分(fēn)爲50 mM Tris (pH 7.4),150 mM NaCl,1% Triton
X-100,1%
sodium deoxycholate,0.1% SDS,以及sodium orthovanadate,sodium
fluoride,EDTA,EGTA等多種抑制劑。可(kě)以有效抑制蛋白(bái)降解。由于含有較高濃度的Triton X-100等幹擾物質,不能用傳統Bradford法測定由本裂解液裂解得(de)到樣品的蛋白(bái)濃度,可(kě)以使用BCA蛋白(bái)濃度測定試劑盒(貨号:RTP7102)或Bradford蛋白(bái)濃度測定試劑盒(去(qù)垢劑兼容型)(貨号:RTP7104)測定蛋白(bái)濃度。
● 保存條件(jiàn):
-20℃保存,一年(nián)有效。
● 注意事(shì)項:
1.爲取得(de)最佳的使用效果,盡量避免過多的反複凍融。可(kě)以适當分(fēn)裝後使用。需自(zì)備PMSF。裂解樣品的所有步驟都(dōu)需在冰上或4℃進行。
2. RIPA裂解液的裂解産物中經常會出現一小團透明膠狀物,屬正常現象。該透明膠狀物爲含有基因組DNA等的複合物。在不檢測與基因組DNA結合特别緊密的蛋白(bái)的情況下,可(kě)以直接離(lí)心取上清用于後續實驗;如(rú)果需要檢測和基因組結合特别緊密的蛋白(bái),則可(kě)以通過超聲處理(lǐ)打碎打散該透明膠狀物,随後離(lí)心取上清用于後續實驗。如(rú)果檢測一些常見(jiàn)的轉錄因子,例如(rú)NF-kappaB、p53等時,通常不必進行超聲處理(lǐ),就(jiù)可(kě)以檢測到這些轉錄因子。
● 使用說(shuō)明:
1. 準備RIPA裂解液:
融解RIPA裂解液,混勻;取适當量的裂解液,在使用前數分(fēn)鍾内加入1/100體(tǐ)積的100 mM PMSF,使PMSF的最終濃度爲1 mM。
2. 細胞蛋白(bái)提取:
2.1 貼壁細胞:去(qù)除培養液,加入适量1×PBS,輕柔漂洗一遍,不要擾動貼壁細胞。按照(zhào)6孔闆每孔加入100-200 μl裂解液的比例加入裂解液,移液器吹打數下,使裂解液和細胞充分(fēn)接觸,冰上裂解細胞5分(fēn)鍾,用細胞刮刀刮下細胞收集于1.5 ml離(lí)心管中,冰上繼續裂解15分(fēn)鍾,間歇混勻。
培養闆規格/培養皿表面積
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細胞量
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RIPA推薦使用量
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100 mm培養皿
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1.5×107
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0.5-1 ml
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60 mm培養皿
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5×106
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0.25-0.5 ml
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35 mm培養皿
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2×106
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0.2-0.4 ml
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6孔闆
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2.5×106
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100-200 μl
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24孔闆
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5×105
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100-150 μl
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96孔闆
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1×105
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50-100 μl
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2.2 懸浮細胞:450 g
4℃ 離(lí)心5 min收集細胞;用适量1×PBS重懸細胞,450 g 4℃ 離(lí)心5 min收集細胞;重複漂洗細胞一次;按照(zhào)細胞沉澱體(tǐ)積(PCM)20 μl加入200 μl RIPA的比例加入RIPA,混勻細胞沉澱,冰浴處理(lǐ)15分(fēn)鍾,間歇混勻。
注:2×106 Jurkat細胞,其細胞沉澱體(tǐ)積(PCM,Packed Cell Volume)大(dà)約爲20 μl。
2.3 裂解細胞:
裂解混合物超聲波處理(lǐ)(超聲條件(jiàn)根據儀器調整,建議(yì)條件(jiàn)爲);如(rú)沒有超聲破碎儀,可(kě)以使用注射器用27G針頭處理(lǐ)裂解物10-15次(貨号:PE2719 ,蛋白(bái)提取針頭套裝),以徹底裂解細胞。冰浴處理(lǐ)15分(fēn)鍾。
注:裂解中細胞會釋放(fàng)出變性的核酸,呈團狀粘稠透明樣,如(rú)不進行超聲或針頭裂解處理(lǐ),會導緻裂解物非常粘稠,大(dà)大(dà)降低蛋白(bái)提取的得(de)率和純度。
2.4 離(lí)心收集上清:
充分(fēn)裂解後,4℃ 16000
g離(lí)心10分(fēn)鍾,取上清,即可(kě)進行後續的PAGE、Western和免疫沉澱等操作(zuò)。
3. 組織樣品蛋白(bái)提取:
3.1 手術(shù)切除的組織塊迅速置于預冷(lěng)的生(shēng)理(lǐ)鹽水中,漂洗數次,洗淨組織血迹,用濾紙吸
幹組織表面液體(tǐ),将組織切成細小的碎片。
3.2 按照(zhào)每20 mg組織加入200 μl裂解液的比例加入裂解液。(如(rú)果裂解不充分(fēn)可(kě)以适當添加更多的裂解液,如(rú)果需要高濃度的蛋白(bái)樣品,可(kě)以适當減少裂解液的用量。)
3.3 用玻璃勻漿器冰浴勻漿5-10次,收集勻漿後的裂解混合物,超聲波處理(lǐ)(超聲條件(jiàn)根據儀器調整,建議(yì)條件(jiàn)爲);如(rú)沒有超聲破碎儀,可(kě)以使用注射器用27G針頭處理(lǐ)裂解物10-15次(貨号:PE2719 ,蛋白(bái)提取針頭套裝),以徹底裂解細胞。裂解物冰浴處理(lǐ)15分(fēn)鍾。
注:裂解中細胞會釋放(fàng)出變性的核酸,呈團狀粘稠透明樣,如(rú)不進行超聲或針頭裂解處理(lǐ),會導緻裂解物非常粘稠,大(dà)大(dà)降低蛋白(bái)提取的得(de)率和純度。
3.4 充分(fēn)裂解後,4℃ 16000
g離(lí)心10分(fēn)鍾,取上清,即可(kě)進行後續的PAGE、Western和免疫沉澱等操作(zuò)。
實驗示例:
Jurkat RIPA總蛋白(bái)提取,GAPDH檢測
總蛋白(bái)提取:4×106 Jurkat細胞,450 g 離(lí)心收集,去(qù)上清,PBS漂洗兩次,沉澱中加入200 μl RIPA(加2 μl 100 mM PMSF),冰上裂解5分(fēn)鍾,4℃ 16000 g 15 分(fēn)鍾,上清即爲總蛋白(bái)(TP)。
電泳:RTD6132-15%3.3C 200 V 33-12 mA 55 min
轉膜:NC膜,1×RealBlot快(kuài)速轉膜液濕轉,穩流400 mA,電壓變化64-57 V,轉膜時間35 min
封閉:無蛋白(bái)快(kuài)速封閉液,RT 20 min
一抗孵育:GAPDH 羊抗兔多抗,一抗稀釋液稀釋1:2000
二抗孵育:羊抗兔IgG-HRP,二抗稀釋液稀釋1:5000
檢測:ECL發光(guāng)檢測
實驗示例:
1、作(zuò)用:①利用去(qù)污劑破壞脂質雙分(fēn)子層,破裂細胞;②溶解蛋白(bái);③蛋白(bái)變性使其穩定;④抑制蛋白(bái)酶/核酸酶活性(根據後續實驗的目的不同,裂解液中會加入蛋白(bái)酶抑制劑或DNA/RNA酶抑制劑,方便目的物的提取。)2、細胞裂解液有效成分(fēn)一般使用的是去(qù)污劑。去(qù)污劑是由一個疏水尾端基團和一個極性親水頭端基團組成的有機(jī)化合物。在一定的溫度條件(jiàn)下,以特定濃度溶解于水時,去(qù)污劑分(fēn)子會形成膠束,疏水基團部分(fēn)位于膠束内部,而極性親水基團則在其外部。去(qù)污劑膠束的疏水核心區域與蛋白(bái)質的疏水表面結合,形成可(kě)溶性的蛋白(bái)質-去(qù)垢劑複合物。去(qù)污劑根據其親水基團的不同分(fēn)爲:陰/陽離(lí)子去(qù)污劑、非離(lí)子型兩性去(qù)污劑、兩性去(qù)污劑。1)陰/陽離(lí)子型去(qù)污劑:離(lí)子去(qù)污劑是由一個疏水鏈和一個陽離(lí)子或陰離(lí)子的極性頭端基團組成。此類去(qù)污劑活性較強,作(zuò)用強烈,會更大(dà)程度的改變蛋白(bái)質的結構,更容易受到pH、離(lí)子強度和反離(lí)子的性質等因素影(yǐng)響。如(rú)陰離(lí)子去(qù)污劑-十二烷基硫酸鈉(SDS)、陰離(lí)子去(qù)污劑-脫氧膽酸鈉(Sodium deoxycholate)等。
離(lí)子型去(qù)污劑:非離(lí)子型去(qù)污劑和離(lí)子型不同,它們的頭端基團是沒有極性的親水基團,是比較溫和的表面活性劑。它們可(kě)以破壞蛋白(bái)質-脂質以及脂質-脂質之間的連接,但(dàn)是不能破壞蛋白(bái)質-蛋白(bái)質的連接,而且大(dà)多非離(lí)子去(qù)污劑不能使蛋白(bái)質變性。因此,這種去(qù)污劑可(kě)以使蛋白(bái)質溶解和分(fēn)離(lí),但(dàn)卻保留了蛋白(bái)質的天然構象、功能以及它們的相(xiàng)互作(zuò)用。如(rú)Triton X-100、乙基苯基聚乙二醇(NP-40)、Tween-80等。
3)兩性去(qù)污劑:兩性離(lí)子去(qù)污劑頭端基團是親水性,含有正負電荷各一個,因此呈現電中性。兩性去(qù)污劑在酸性溶液中是正離(lí)子,在堿性溶液是負離(lí)子, 可(kě)在任何酸堿度的溶液中使用。相(xiàng)對于離(lí)子型去(qù)污劑其更少産生(shēng)變性,相(xiàng)對于非離(lí)子型去(qù)污劑,又可(kě)以更有效的破壞蛋白(bái)質-蛋白(bái)質鍵并減少聚集。如(rú)CHAPS。Tris,三羟甲基氨基甲烷,是一種有機(jī)化合物,溶于乙醇和水,是核酸和蛋白(bái)質的溶劑,廣泛應用于生(shēng)物化學和分(fēn)子生(shēng)物學實驗中緩沖液的制備。
Tris爲弱堿,在25°C下,它的pKa爲8.1;根據緩沖理(lǐ)論,Tris緩沖液的有效緩沖範圍在pH7.0到9.2之間。0.1mol/l的水溶液pH爲10.4,一般加入鹽酸以調節pH值,即可(kě)獲得(de)所需pH值的緩沖液。
主要應用有:①1M Tris-HCl pH6.8、1.5M Tris-HCl pH8.8和5×Tris-甘氨酸電泳緩沖液是SDS-PAGE最常用的試劑。②在Tris鹽酸緩沖液中加入EDTA制成“TE緩沖液”,TE緩沖液被用于DNA的穩定和儲存。将調節pH值的鹽酸換爲乙酸即可(kě)以得(de)到“TAE(Tris/Acetate/EDTA)緩沖液”,換成硼酸則獲得(de)“TBE(Tris/Borate/EDTA)緩沖液”。TAE和TBE緩沖液常用于核酸電泳實驗中。
不同裂解成分(fēn)的裂解強度不同,可(kě)以根據不同的實驗需求選用不同的裂解液。
1、NP40 lysis buffer:主要成分(fēn)爲50mM Tris(pH7.4),150mM NaCl,1% NP-40。NP-40是一種很溫和的非離(lí)子型去(qù)污劑,1%濃度基本可(kě)以破壞掉細胞膜,而對核膜的破壞作(zuò)用較弱,結合特定的緩沖液可(kě)以獲得(de)胞漿蛋白(bái),适用于膜蛋白(bái)非變性條件(jiàn)下的溶解。與蛋白(bái)結合力強,用于防止物質分(fēn)子疏水間相(xiàng)互作(zuò)用,确保蛋白(bái)的充分(fēn)溶解和結構穩定。常用于常規的Western、IP和co-IP和ELISA,如(rú)需要裂解細胞核膜獲取核蛋白(bái),可(kě)用1%NP40+0.1%SDS(WB實驗)或用1%NP40+超聲(IP實驗)。2、SDS lysis buffer:主要成分(fēn)爲50mM Tris (pH8.1),1% SDS;是一種比較強烈的細胞組織裂解液,可(kě)裂解核膜;用于常規Western、ChIP等。3、RIPA裂解液:組分(fēn)爲25 mM Tris-HCl, pH 7.6、150 mM NaCl、1% NP-40、1%脫氧膽酸鈉、0.1%十二烷基硫酸鈉(SDS)。RIPA裂解液是一種傳統的細胞組織快(kuài)速裂解液,獲得(de)的蛋白(bái)樣品可(kě)用于常規WB、IP等實驗。
4、IP裂解液:組分(fēn)爲25 mM Tris-HCl, pH 7.4、150 mM NaCl、1% NP-40、1% mM EDTA、5% 甘油。IP裂解液是一種改良後的RIPA裂解液,具中等強度效力,可(kě)高效溶解細胞蛋白(bái),但(dàn)不會像RIPA一樣釋放(fàng)染色體(tǐ)組DNA或破壞蛋白(bái)複合物。适合下遊免疫沉澱或親和吸附應用。
5、Tris-Triton裂解液:組分(fēn)爲10mM Tris,pH7.4、100mM NaCl、1mM EDTA、1mM EGTA(鈣離(lí)子螯合劑)、1% Triton X-100、10% 甘油、0.1% SDS、0.5% 脫氧膽酸鈉。Tris-Triton裂解液是非離(lí)子型表面活性劑,效力介于NP-40和SDS之間,下遊應用有WB、ELISA、IP。
6、紅(hóng)細胞裂解液:
紅(hóng)細胞裂解液是一種比較溫和的紅(hóng)細胞去(qù)除方法,它既不損傷有核細胞又能充分(fēn)的去(qù)除紅(hóng)細胞;主要用于經酶消化分(fēn)散的組織細胞的分(fēn)離(lí)純化,淋巴細胞的分(fēn)離(lí)純化以及組織細胞蛋白(bái)與核酸提取等實驗中紅(hóng)細胞的去(qù)除。經紅(hóng)細胞裂解液裂解得(de)到的組織細胞中不含紅(hóng)細胞,可(kě)進一步用于原代培養、細胞融合、流式細胞分(fēn)析、核酸與蛋白(bái)的分(fēn)離(lí)和提取等。
氯化铵是紅(hóng)細胞裂解液的主要效應物質,氨根離(lí)子不能通過細胞膜,而其他(tā)離(lí)子可(kě)以通過,造成細胞内外的離(lí)子濃度差異,形成了滲透壓差,外部的水分(fēn)會擴散至細胞内,使紅(hóng)細胞膨脹,達到裂解的效果。由于紅(hóng)細胞結構相(xiàng)對簡單,因此膨脹的耐受能力較差,絕大(dà)部分(fēn)就(jiù)會被漲破。碳酸鹽的主要作(zuò)用爲PH緩沖。EDTA與鎂離(lí)子和鈣離(lí)子形成的螯合物主要起到破壞細胞膜穩态的作(zuò)用,此作(zuò)用對白(bái)細胞影(yǐng)響很小,所以這種裂解液可(kě)以在裂解紅(hóng)細胞的同時較小的影(yǐng)響白(bái)細胞。
RIPA 貨号:RL1020
使用該産品發表部分(fēn)文章(zhāng)列表:
1. [2022 IF=2.1] METTL3-mediated methylation of CYP2C19
mRNA may aggravate clopidogrel resistance in ischemic stroke patients.
Author: Quandan Tan, Le Yang, Shanshan Yuan, Danni
Zheng, Yapeng Lin, Kejie Chen, Ying He, Shuntian Chen, Junli Hao, Jin Dai, Song
He, Fengkai Mao, Xinyi Leng, Haisong Jiang, Jie Yang.
Journal: Open Medicine 2024; 19: 20240899.
Institution: University of Electronic Science and
Technology of China
Paper link:https://doi.org/10.1515/med-2024-0899