RIPA裂解液(中)
● 産品包裝：
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産品編号
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産品名稱
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産品包裝
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說(shuō)明書(shū)
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RL0130
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RIPA裂解液(中)
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100 ml
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1份
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● 産品簡介：
RIPA裂解液(RIPA Lysis
Buffer)是一種傳統的細胞組織快(kuài)速裂解液。RIPA裂解液裂解得(de)到的蛋白(bái)樣品可(kě)以用于常規的Western、IP等。RIPA的本意是Radio Immunoprecipitation Assay。RIPA裂解液的配方有很多種，根據其裂解液的強度大(dà)緻可(kě)以分(fēn)爲強、中、弱三類。RIPA裂解液(中)的主要成分(fēn)爲Tris
(pH 7.4)， NaCl， 1% NP-40， 0.5%
sodium deoxycholate， 0.1%
SDS，以及sodium orthovanadate，sodium fluoride，EDTA，leupeptin等多種抑制劑，可(kě)以有效抑制蛋白(bái)降解。用RIPA裂解液裂解得(de)到的蛋白(bái)樣品，可(kě)以用BCA蛋白(bái)濃度測定試劑盒測定蛋白(bái)濃度。由于含有較高濃度的去(qù)垢劑，不能用Bradford法測定由本裂解液裂解得(de)到樣品的蛋白(bái)濃度。
● 保存條件(jiàn)：
-20℃保存，一年(nián)有效。
● 注意事(shì)項：
1.爲取得(de)最佳的使用效果，盡量避免過多的反複凍融。可(kě)以适當分(fēn)裝後使用。需自(zì)備PMSF。裂解樣品的所有步驟都(dōu)需在冰上或4℃進行。
2. RIPA裂解液的裂解産物中經常會出現一小團透明膠狀物，屬正常現象。該透明膠狀物爲含有基因組DNA等的複合物。在不檢測與基因組DNA結合特别緊密的蛋白(bái)的情況下，可(kě)以直接離(lí)心取上清用于後續實驗；如(rú)果需要檢測和基因組結合特别緊密的蛋白(bái)，則可(kě)以通過超聲處理(lǐ)打碎打散該透明膠狀物，随後離(lí)心取上清用于後續實驗。如(rú)果檢測一些常見(jiàn)的轉錄因子，例如(rú)NF-kappaB、p53等時，通常不必進行超聲處理(lǐ)，就(jiù)可(kě)以檢測到這些轉錄因子。
● 使用說(shuō)明：
1. 準備RIPA裂解液：
融解RIPA裂解液，混勻；取适當量的裂解液，在使用前數分(fēn)鍾内加入1/100體(tǐ)積的100 mM PMSF，使PMSF的最終濃度爲1 mM。
2. 細胞蛋白(bái)提取：
2.1 貼壁細胞：去(qù)除培養液，加入适量1×PBS，輕柔漂洗一遍，不要擾動貼壁細胞。按照(zhào)6孔闆每孔加入100-200 μl裂解液的比例加入裂解液，移液器吹打數下，使裂解液和細胞充分(fēn)接觸，冰上裂解細胞5分(fēn)鍾，用細胞刮刀刮下細胞收集于1.5 ml離(lí)心管中，冰上繼續裂解15分(fēn)鍾，間歇混勻。
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培養闆規格/培養皿表面積
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細胞量
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RIPA推薦使用量
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100 mm培養皿
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1.5×107
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0.5-1 ml
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60 mm培養皿
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5×106
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0.25-0.5 ml
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35 mm培養皿
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2×106
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0.2-0.4 ml
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6孔闆
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2.5×106
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100-200 μl
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24孔闆
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5×105
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100-150 μl
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96孔闆
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1×105
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50-100 μl
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2.2 懸浮細胞：450 g
4℃ 離(lí)心5 min收集細胞；用适量1×PBS重懸細胞，450 g 4℃ 離(lí)心5 min收集細胞；重複漂洗細胞一次；按照(zhào)細胞沉澱體(tǐ)積（PCV）20 μl加入200 μl RIPA的比例加入RIPA，混勻細胞沉澱，冰浴處理(lǐ)15分(fēn)鍾，間歇混勻。
注：2×106 Jurkat細胞，其細胞沉澱體(tǐ)積（PCV，Packed Cell Volume）大(dà)約爲20 μl。
2.3 裂解細胞：
裂解混合物超聲波處理(lǐ)（超聲條件(jiàn)根據儀器調整，建議(yì)條件(jiàn)爲）；如(rú)沒有超聲破碎儀，可(kě)以使用注射器用27G針頭處理(lǐ)裂解物10-15次（貨号：PE2719 ，蛋白(bái)提取針頭套裝），以徹底裂解細胞。冰浴處理(lǐ)15分(fēn)鍾。
注：裂解中細胞會釋放(fàng)出變性的核酸，呈團狀粘稠透明樣，如(rú)不進行超聲或針頭裂解處理(lǐ)，會導緻裂解物非常粘稠，大(dà)大(dà)降低蛋白(bái)提取的得(de)率和純度。
2.4 離(lí)心收集上清：
充分(fēn)裂解後，4℃ 16000
g離(lí)心10分(fēn)鍾，取上清，即可(kě)進行後續的PAGE、Western和免疫沉澱等操作(zuò)。
3. 組織樣品蛋白(bái)提取：
3.1 手術(shù)切除的組織塊迅速置于預冷(lěng)的生(shēng)理(lǐ)鹽水中，漂洗數次，洗淨組織血迹，用濾紙吸
幹組織表面液體(tǐ)，将組織切成細小的碎片。
3.2 按照(zhào)每20 mg組織加入200 μl裂解液的比例加入裂解液。(如(rú)果裂解不充分(fēn)可(kě)以适當添加更多的裂解液，如(rú)果需要高濃度的蛋白(bái)樣品，可(kě)以适當減少裂解液的用量。)
3.3 用玻璃勻漿器冰浴勻漿5-10次，收集勻漿後的裂解混合物，超聲波處理(lǐ)（超聲條件(jiàn)根據儀器調整，建議(yì)條件(jiàn)爲）；如(rú)沒有超聲破碎儀，可(kě)以使用注射器用27G針頭處理(lǐ)裂解物10-15次（貨号：PE2719 ，蛋白(bái)提取針頭套裝），以徹底裂解細胞。裂解物冰浴處理(lǐ)15分(fēn)鍾。
注：裂解中細胞會釋放(fàng)出變性的核酸，呈團狀粘稠透明樣，如(rú)不進行超聲或針頭裂解處理(lǐ)，會導緻裂解物非常粘稠，大(dà)大(dà)降低蛋白(bái)提取的得(de)率和純度。
3.4 充分(fēn)裂解後，4℃ 16000
g離(lí)心10分(fēn)鍾，取上清，即可(kě)進行後續的PAGE、Western和免疫沉澱等操作(zuò)。
實驗示例：
Jurkat RIPA總蛋白(bái)提取，GAPDH檢測
總蛋白(bái)提取：4×106 Jurkat細胞，450 g 離(lí)心收集，去(qù)上清，PBS漂洗兩次，沉澱中加入200 μl RIPA（加2 μl 100 mM PMSF），冰上裂解5分(fēn)鍾，4℃ 16000 g 15 分(fēn)鍾，上清即爲總蛋白(bái)（TP）。
電泳：RTD6132-15%3.3C 200 V 33-12 mA 55 min
轉膜：NC膜，1×RealBlot快(kuài)速轉膜液濕轉，穩流400 mA，電壓變化64-57 V，轉膜時間35 min
封閉：無蛋白(bái)快(kuài)速封閉液，RT 20 min
一抗孵育：GAPDH 羊抗兔多抗，一抗稀釋液稀釋1：2000
二抗孵育：羊抗兔IgG-HRP，二抗稀釋液稀釋1：5000
檢測：ECL發光(guāng)檢測
