2×GC Buffer
● 産品組成：
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目錄号
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規格
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價格
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RTB3101-01
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1ml
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RTB3101-03
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10×1ml
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300元
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● 保存：-20℃
● 用途：
PCR 擴增複雜結構的 DNA 片段。
● 産品說(shuō)明和注意事(shì)項：
1. 本産品能與各種PCR酶配合使用，能夠擴增具有複雜二級結構模闆（GC rich、重複序列等）的PCR片段。
2. 使用 GC Buffer 進行 PCR 擴增時，建議(yì)使用 Tm 值較高的引物。因此，引物最好設計(jì)在 30 mer 左右。
3. 使用 GC Buffer擴增的 GC rich 的DNA 片段長度，會因 GC 含量不同而各有差異。
4. 由于 GC Buffer 和一般的PCR Buffer 相(xiàng)比 DNA 變性效果較強，因此，一般的 DNA片段（GC含量低于50%的目的片段）不推薦使用2×GC buffer進行擴增。
● 使用說(shuō)明：
1.
按照(zhào)下表在0.2ml
PCR管中制備反應體(tǐ)系：
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成分(fēn)
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25μl反應體(tǐ)系
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50μl反應體(tǐ)系
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終濃度
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Template
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0.05-0.5 μg
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0.1-1 μg
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as you wish
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Primer 1（10
μM）
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0.5 μl
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1 μl
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200nM
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Primer 2（10
μM）
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0.5 μl
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1 μl
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200nM
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2×GC buffer
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12.5 μl
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25 μl
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1×
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dNTP Mixture(10 mM)
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0.5 μl
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1 μl
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200μM each
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Taq (5 U/μl)
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0.25-0.5 μl
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0.5-1 μl
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2.5-5U
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ddH2O
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up to 25 μl
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up to 50 μl
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-
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2. 混勻後，離(lí)心快(kuài)甩将反應液收集到管底。
3. PCR儀如(rú)果沒有熱(rè)蓋加熱(rè)的話(huà)，補加25μl礦物油。
4. PCR儀上執行以下程序：
兩步法：
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步驟
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溫度
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時間
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循環數
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初始變性
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94℃
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5 min
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1
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變性
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94℃
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30 sec
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25-40*
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退火(huǒ)和延伸
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68℃
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1 min/kb
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最後延伸
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72℃
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5 min
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1
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*注： PCR 反應條件(jiàn)視模闆、引物等的結構條件(jiàn)不同而各異。在實際操作(zuò)中需根據模闆、目的片段的大(dà)小、堿基序列和引物的長短(duǎn)等具體(tǐ)情況，設定最佳的反應條件(jiàn)（溫度、時間等）。
1. 怎樣确定擴增片段的GC含量大(dà)小？
推薦使用Oligo軟件(jiàn)分(fēn)析片段的GC含量(如(rú)下圖所示)。
2.
2×GC
buffer能擴增正常GC含量片段嗎(ma)？
2×GC
buffer可(kě)以擴增GC含量正常的模闆。然而，由于GC
buffer有比較強的變性效果，因此一般的模闆使用GC buffer擴增時，有時會降低擴增效率。
3.
2×GC
buffer能兼容大(dà)多數PCR用酶嗎(ma)？
2×GC
buffer能兼容大(dà)多數PCR酶，比如(rú)Taq，Taq
plus，Long Taq等，可(kě)以根據片段長度以及保真性要求選擇不同的酶。
4. 使用GC
buffer擴增時，爲什麽推薦使用兩步法？
由于目的片段GC含量高，引物的Tm值往往會比較高，在PCR時，當退火(huǒ)溫度和延伸溫度差距較小時，比如(rú)退火(huǒ)溫度超過60℃時，退火(huǒ)溫度和延伸溫度可(kě)以設成同一數值，一般爲68℃。
2×GC buffer
lane 1-5: Rice 390bp fragement(GC% 77.1%)
lane 6-10: Rice 760bp fragement(GC% 72.9%)
lane 1 and 6: TaKaRa 2×GC buffer I
lane 2 and 7: TaKaRa 2×GC buffer II
lane 3 and 8: RTB3101 2×GC buffer
lane 4 and 9: RTB3106 10×Taq PCR buffer
lane 5: Rice 390bp，RTB3101 2×GC buffer, 三步法擴增
lane 10: Rice 760bp，RTB3101 2×GC buffer, 三步法擴增
