蛋白(bái)PAGE凝膠快(kuài)速制備試劑盒(紅(hóng)色上層膠)
貨号
|
說(shuō)明
|
規格
|
RTD6133
|
蛋白(bái)PAGE凝膠快(kuài)速制備試劑盒(紅(hóng)色上層膠)
|
45-90闆膠
|
Protein PAGE Gel Fast Preparation Kit (Red Stacking Gel)
● 貨品内容:
組份
|
貨号
|
名稱
|
規格
|
保存
|
1
|
AC2914-01
|
40%PAA(29:1)
|
100 ml
|
4℃
|
2
|
RTD6133-UA
|
紅(hóng)色上層膠溶液A(2×)
|
50 ml
|
4℃
|
3
|
RTD6133-LB
|
下層膠溶液B(2×)
|
180 ml
|
4℃
|
4
|
RTD6133-SP
|
改良型促凝劑
|
8 ml
|
4℃,配制後-20℃貯存
|
5
|
1018210CM
|
1.0 mm玻璃闆/梳子套裝
|
2套
|
RT
|
6
|
|
說(shuō)明書(shū)
|
|
-
|
● 産品簡介:
該産品利用聚丙烯酰胺凝膠電泳原理(lǐ),采用合理(lǐ)設計(jì)的預混合配方和配制流程,可(kě)在30-50分(fēn)鍾内配制得(de)到高質量的聚丙烯酰胺凝膠,用于變性和非變性蛋白(bái)凝膠電泳。本産品可(kě)以配制常用下層膠濃度6%、8%、10%、12%和15%,可(kě)以滿足絕大(dà)多數蛋白(bái)電泳需求。
本試劑盒可(kě)配制45-90塊常規大(dà)小(8×10cm)的PAGE膠,具體(tǐ)凝膠數量和凝膠濃度、厚度以及凝膠的大(dà)小有關。按照(zhào)10%凝膠,大(dà)小8×10cm,可(kě)以配置0.75 mm厚度凝膠約90闆,1.0 mm厚度凝膠約68闆,1.5 mm厚度凝膠約45闆。
● 運輸和貯存:
本産品常溫運輸;組份按照(zhào)标簽溫度貯存;有效期一年(nián)。
● 特點:
1. 方便:紅(hóng)色上層膠,方便上樣;
2. 安全:不用接觸有毒粉末;不用單獨添加TEMED;
3. 兼容性廣:制膠溶液中不含SDS,可(kě)用于非變性電泳(Native-PAGE);
4. 配備1.0 mm厚度玻璃闆和電泳梳子,方便實驗。
● 使用說(shuō)明:
一 凝膠制備:
1.1參照(zhào)凝膠模具說(shuō)明書(shū),裝配好凝膠模具。
1.2 根據下表參考選擇合适的凝膠濃度:
下層膠(下層膠)濃度
|
最佳分(fēn)離(lí)範圍
|
6%
|
50-350 kD
|
8%
|
35-300 kD
|
10%
|
20-150 kD
|
12%
|
15-100 kD
|
15%
|
10-80 kD
|
1.3配制一塊常用凝膠(10×8 cm)所需下層膠和上層膠體(tǐ)積(下層膠按6厘米高度計(jì)算,上層膠按1.5厘米高度計(jì)算,均含約0.2 ml的冗餘量)參見(jiàn)下表。
凝膠厚度
|
下層膠體(tǐ)積
|
上層膠體(tǐ)積
|
0.75 mm
|
4.0 ml
|
1.0 ml
|
1.0 mm
|
5.0 ml
|
1.5 ml
|
1.5 mm
|
8.0 ml
|
2.0 ml
|
注:下層膠體(tǐ)積已包含适量冗餘,請(qǐng)勿全部用于灌制下層膠,以免灌膠時上層膠高度不夠。
1.4配制下層膠:
參考下表,配制不同濃度的下層膠。适當混勻後倒入到制膠模具中,用蒸餾水或異丙醇或無水乙醇封住液面,直至下層膠凝固充分(fēn)後再進行PAGE上層膠的配制。通常25℃ 10-40分(fēn)鍾内下層膠會凝固。注:凝膠的聚合時間與環境溫度有關。夏天溫度較高時,聚合較快(kuài);冬天氣溫低時,聚合時間會延長。上層膠25℃ 10-15分(fēn)鍾可(kě)以聚合凝固;18℃ 35-40分(fēn)鍾可(kě)以聚合凝固。
組份
|
不同凝膠體(tǐ)積對應各組份的取樣量(ml)
|
6% 膠
|
5
ml
|
10
ml
|
15
ml
|
20
ml
|
H2O
|
1.7
|
3.4
|
5.1
|
6.8
|
下層膠溶液B(2×)
|
2.5
|
5.0
|
7.5
|
10.0
|
40% PAA(29:1)
|
0.75
|
1.5
|
2.25
|
3.0
|
改良型促凝劑
|
0.05
|
0.1
|
0.15
|
0.2
|
8% 膠
|
5 ml
|
10 ml
|
15 ml
|
20 ml
|
H2O
|
1.45
|
2.9
|
4.35
|
5.8
|
下層膠溶液B(2×)
|
2.5
|
5.0
|
7.5
|
10.0
|
40% PAA(29:1)
|
1.0
|
2.0
|
3.0
|
4.0
|
改良型促凝劑
|
0.05
|
0.1
|
0.15
|
0.2
|
10% 膠
|
5
ml
|
10
ml
|
15
ml
|
20
ml
|
H2O
|
1.2
|
2.4
|
3.6
|
4.8
|
下層膠溶液B(2×)
|
2.5
|
5.0
|
7.5
|
10.0
|
40% PAA(29:1)
|
1.25
|
2.5
|
3.75
|
5.0
|
改良型促凝劑
|
0.05
|
0.1
|
0.1
|
0.2
|
12% 膠
|
5
ml
|
10
ml
|
15
ml
|
20
ml
|
H2O
|
0.95
|
1.9
|
2.85
|
3.8
|
下層膠溶液B(2×)
|
2.5
|
5.0
|
7.5
|
10.0
|
40% PAA(29:1)
|
1.5
|
3.0
|
4.5
|
6.0
|
改良型促凝劑
|
0.05
|
0.1
|
0.15
|
0.2
|
15% 膠
|
5
ml
|
10
ml
|
15
ml
|
20
ml
|
H2O
|
0.575
|
1.15
|
1.725
|
2.3
|
下層膠溶液B(2×)
|
2.5
|
5.0
|
7.5
|
10.0
|
40% PAA(29:1)
|
1.875
|
3.75
|
5.625
|
7.5
|
改良型促凝劑
|
0.05
|
0.1
|
0.15
|
0.2
|
1.5配制上層膠:
按照(zhào)如(rú)下表格配制4% PAGE上層膠。下層膠灌注後,去(qù)除壓膠溶液,配制好的上層膠緊貼玻璃闆均勻輕柔注入到下層膠上,小心插入梳子等待凝固。
組份
|
不同凝膠體(tǐ)積對應各組份的取樣量(ml)
|
4%上層膠(上層膠)
|
2
ml
|
4
ml
|
6
ml
|
8
ml
|
H2O
|
0.78
|
1.56
|
2.34
|
3.12
|
紅(hóng)色上層膠溶液A(2×)
|
1.0
|
2.0
|
3.0
|
4.0
|
40% PAA(29:1)
|
0.2
|
0.4
|
0.6
|
0.8
|
改良型促凝劑
|
0.02
|
0.04
|
0.06
|
0.08
|
注:紅(hóng)色上層膠緩沖液(2×)使用前須搖勻。
注:凝膠的聚合時間與環境溫度有關。夏天溫度較高時,聚合較快(kuài);冬天氣溫低時,聚合時間會延長。
上層膠25℃ 20-25分(fēn)鍾可(kě)以聚合凝固;18℃ 35-40分(fēn)鍾可(kě)以聚合凝固。
二 電泳:
2.1 SDS-PAGE變性電泳:
2.1.1電泳緩沖液配制:
将5×Tris-甘氨酸-SDS電泳緩沖液幹粉(自(zì)備,組份0.96 M 甘氨酸,0.125 M Tris,0.5% SDS)全部倒入1L燒杯中,加入約900 ml水徹底溶解,用水定容至1 L,即配成5×Tris-甘氨酸電泳緩沖液(此溶液不用調節pH值)。用前再稀釋5倍即配成1×Tris-甘氨酸-SDS電泳緩沖液。
2.1.2 樣品處理(lǐ):融化-混合-變性-上樣
5×蛋白(bái)上樣緩沖液(變性,還(hái)原)常溫數分(fēn)鍾解凍後輕輕搖勻,以确保溶液混合均勻;将緩沖液與蛋白(bái)樣品按照(zhào)1:4的比例混勻,如(rú)8 μl樣品加入2 μl
5×上樣緩沖液;将蛋白(bái)樣品置于95℃中加熱(rè)5-10分(fēn)鍾;蛋白(bái)樣品加入凝膠加樣孔内電泳。
2.1.3 電泳過程;
在電泳槽的内槽内加入1×Tris-甘氨酸-SDS電泳緩沖液(讓電泳緩沖液漫過加樣孔),輕輕的撥出梳子,用1ml吸頭徹底沖洗加樣孔,随後在電泳槽外槽加入适量的1×Tris-甘氨酸-SDS電泳緩沖液。
SDS-PAGE電泳條件(jiàn)
恒電壓
|
起始電流(一闆膠)
|
結束電流(一闆膠)
|
電泳時間
|
适用條件(jiàn)
|
150V
|
35-40
mA
|
15-20
mA
|
55
+ min
|
最佳電壓,最優的分(fēn)辨率
|
200V
|
45-55
mA
|
20-25
mA
|
45+
min
|
節省時間
|
225V
|
40-50
mA
|
15-20
mA
|
35+
min
|
250V
|
65-75
mA
|
20-25
mA
|
30+
min
|
300V
|
70-80
mA
|
25-35mA
|
25+
min
|
最省時間
|
2.2 非變性電泳(Native PAGE):
2.2.1電泳緩沖液配制:
将5×Tris-甘氨酸電泳緩沖液幹粉(自(zì)備,組份0.96 M 甘氨酸,0.125 M Tris)全部倒入1L燒杯中,加入約900 ml水徹底溶解,用水定容至1 L,即配成5×Tris-甘氨酸電泳緩沖液(此溶液不用調節pH值)。用前再稀釋5倍即配成1×Tris-甘氨酸-SDS電泳緩沖液。
2.2.2 樣品處理(lǐ):融化-混合-上樣
5×非變性非還(hái)原蛋白(bái)上樣緩沖液常溫數分(fēn)鍾解凍後輕輕搖勻,以确保溶液混合均勻;将緩沖液與蛋白(bái)樣品按照(zhào)1:4的比例混勻,如(rú)8 μl樣品加入2 μl
5×上樣緩沖液;蛋白(bái)樣品加入凝膠加樣孔内電泳。注:非變性電泳樣品不能加熱(rè)處理(lǐ)。
2.2.3 電泳過程;
在電泳槽的内槽内加入1×Tris-甘氨酸電泳緩沖液(讓電泳緩沖液漫過加樣孔),輕輕的撥出梳子,用1ml吸頭徹底沖洗加樣孔,随後在電泳槽外槽加入适量的1×Tris-甘氨酸電泳緩沖液。
Native PAGE電泳條件(jiàn)
|
恒電壓
|
起始電流
|
結束電流
|
電泳時間
|
适用條件(jiàn)
|
推薦電壓
|
150V
|
25-35/闆膠
|
5-10 mA/闆膠
|
60 + min
|
最佳電壓,最優的分(fēn)辨率
|
三. 染色:
1. 将電泳後的PAGE膠取下放(fàng)入塑料容器中,加入适量FastBlue蛋白(bái)染色液或常規考馬斯亮藍染色液(以剛剛覆蓋過膠面爲适),條帶1-2分(fēn)鍾即可(kě)見(jiàn)。
2. 搖床常溫搖動10-15分(fēn)鍾至條帶清晰可(kě)見(jiàn)。
3. 加入适量蒸餾水脫色,期間更換1-2次蒸餾水,搖床常溫搖動10-15分(fēn)鍾至背景幹淨。
4. 觀察保存結果。