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蛋白(bái)PAGE凝膠快(kuài)速制備試劑盒(紅(hóng)色上層膠)

蛋白(bái)PAGE凝膠快(kuài)速制備試劑盒(紅(hóng)色上層膠)

産品編号:RTD6133

産品規格:45-90闆膠

數量
價格 ¥200

蛋白(bái)PAGE凝膠快(kuài)速制備試劑盒(紅(hóng)色上層膠)

貨号

說(shuō)明

規格

RTD6133

蛋白(bái)PAGE凝膠快(kuài)速制備試劑盒(紅(hóng)色上層膠)

45-90闆膠

 Protein PAGE Gel Fast Preparation Kit Red Stacking Gel

●  貨品内容:

組份

貨号

名稱

規格

保存

1

AC2914-01

40%PAA291

100 ml

4

2

RTD6133-UA

紅(hóng)色上層膠溶液A2×)

50 ml

4

3

RTD6133-LB

下層膠溶液B2×)

180 ml

4

4

RTD6133-SP

改良型促凝劑

8 ml

4℃,配制後-20℃貯存

5

1018210CM

1.0 mm玻璃闆/梳子套裝

2

RT

6

說(shuō)明書(shū)

-

産品簡介:

該産品利用聚丙烯酰胺凝膠電泳原理(lǐ),采用合理(lǐ)設計(jì)的預混合配方和配制流程,可(kě)在30-50分(fēn)鍾内配制得(de)到高質量的聚丙烯酰胺凝膠,用于變性和非變性蛋白(bái)凝膠電泳。本産品可(kě)以配制常用下層膠濃度6%、8%、10%、12%和15%,可(kě)以滿足絕大(dà)多數蛋白(bái)電泳需求。

本試劑盒可(kě)配制45-90塊常規大(dà)小(8×10cm)的PAGE膠,具體(tǐ)凝膠數量和凝膠濃度、厚度以及凝膠的大(dà)小有關。按照(zhào)10%凝膠,大(dà)小8×10cm,可(kě)以配置0.75 mm厚度凝膠約90闆,1.0 mm厚度凝膠約68闆,1.5 mm厚度凝膠約45闆。

● 運輸和貯存:

本産品常溫運輸;組份按照(zhào)标簽溫度貯存;有效期一年(nián)。

特點:

1. 方便:紅(hóng)色上層膠,方便上樣;

2. 安全:不用接觸有毒粉末;不用單獨添加TEMED;

3. 兼容性廣:制膠溶液中不含SDS,可(kě)用于非變性電泳(Native-PAGE);

4. 配備1.0 mm厚度玻璃闆和電泳梳子,方便實驗。

使用說(shuō)明:

  凝膠制備:

1.1參照(zhào)凝膠模具說(shuō)明書(shū),裝配好凝膠模具。

1.2 根據下表參考選擇合适的凝膠濃度:

下層膠(下層膠)濃度

最佳分(fēn)離(lí)範圍

6%

50-350 kD

8%

35-300 kD

10%

20-150 kD

12%

15-100 kD

15%

10-80 kD








1.3配制一塊常用凝膠(10×8 cm)所需下層膠和上層膠體(tǐ)積(下層膠按6厘米高度計(jì)算,上層膠按1.5厘米高度計(jì)算,均含約0.2 ml的冗餘量)參見(jiàn)下表。

凝膠厚度

下層膠體(tǐ)積

上層膠體(tǐ)積

0.75 mm

4.0 ml

1.0 ml

1.0 mm

5.0 ml

1.5 ml

1.5 mm

8.0 ml

2.0 ml

注:下層膠體(tǐ)積已包含适量冗餘,請(qǐng)勿全部用于灌制下層膠,以免灌膠時上層膠高度不夠。

1.4配制下層膠:

參考下表,配制不同濃度的下層膠。适當混勻後倒入到制膠模具中,用蒸餾水或異丙醇或無水乙醇封住液面,直至下層膠凝固充分(fēn)後再進行PAGE上層膠的配制。通常25℃ 10-40分(fēn)鍾内下層膠會凝固。注:凝膠的聚合時間與環境溫度有關。夏天溫度較高時,聚合較快(kuài);冬天氣溫低時,聚合時間會延長。上層膠25℃ 10-15分(fēn)鍾可(kě)以聚合凝固;18℃ 35-40分(fēn)鍾可(kě)以聚合凝固。


組份

不同凝膠體(tǐ)積對應各組份的取樣量(ml

6

5 ml

10 ml

15 ml

20 ml

H2O

1.7

3.4

5.1

6.8

下層膠溶液B2×)

2.5

5.0

7.5

10.0

40 PAA29:1

0.75

1.5

2.25

3.0

改良型促凝劑

0.05

0.1

0.15

0.2

8

5 ml

10 ml

15 ml

20 ml

H2O

1.45

2.9

4.35

5.8

下層膠溶液B2×)

2.5

5.0

7.5

10.0

40 PAA29:1

1.0

2.0

3.0

4.0

改良型促凝劑

0.05

0.1

0.15

0.2

10

5 ml

10 ml

15 ml

20 ml

H2O

1.2

2.4

3.6

4.8

下層膠溶液B2×)

2.5

5.0

7.5

10.0

40 PAA29:1

1.25

2.5

3.75

5.0

改良型促凝劑

0.05

0.1

0.1

0.2

12

5 ml

10 ml

15 ml

20 ml

H2O

0.95

1.9

2.85

3.8

下層膠溶液B2×)

2.5

5.0

7.5

10.0

40 PAA29:1

1.5

3.0

4.5

6.0

改良型促凝劑

0.05

0.1

0.15

0.2

15

5 ml

10 ml

15 ml

20 ml

H2O

0.575

1.15

1.725

2.3

下層膠溶液B2×)

2.5

5.0

7.5

10.0

40 PAA29:1

1.875

3.75

5.625

7.5

改良型促凝劑

0.05

0.1

0.15

0.2

1.5配制上層膠:

按照(zhào)如(rú)下表格配制4% PAGE上層膠。下層膠灌注後,去(qù)除壓膠溶液,配制好的上層膠緊貼玻璃闆均勻輕柔注入到下層膠上,小心插入梳子等待凝固。

組份

不同凝膠體(tǐ)積對應各組份的取樣量(ml

4上層膠(上層膠)

2 ml

4 ml

6 ml

8 ml

H2O

0.78

1.56

2.34

3.12

紅(hóng)色上層膠溶液A2×)

1.0

2.0

3.0

4.0

40 PAA29:1

0.2

0.4

0.6

0.8

改良型促凝劑

0.02

0.04

0.06

0.08

注:紅(hóng)色上層膠緩沖液(2×)使用前須搖勻。

注:凝膠的聚合時間與環境溫度有關。夏天溫度較高時,聚合較快(kuài);冬天氣溫低時,聚合時間會延長。

上層膠25℃ 20-25分(fēn)鍾可(kě)以聚合凝固;18℃ 35-40分(fēn)鍾可(kě)以聚合凝固。

  電泳:

2.1 SDS-PAGE變性電泳:

2.1.1電泳緩沖液配制:

将5×Tris-甘氨酸-SDS電泳緩沖液幹粉(自(zì)備,組份0.96 M 甘氨酸,0.125 M Tris,0.5% SDS)全部倒入1L燒杯中,加入約900 ml水徹底溶解,用水定容至1 L,即配成5×Tris-甘氨酸電泳緩沖液(此溶液不用調節pH值)。用前再稀釋5倍即配成1×Tris-甘氨酸-SDS電泳緩沖液。

2.1.2 樣品處理(lǐ):融化-混合-變性-上樣

5×蛋白(bái)上樣緩沖液(變性,還(hái)原)常溫數分(fēn)鍾解凍後輕輕搖勻,以确保溶液混合均勻;将緩沖液與蛋白(bái)樣品按照(zhào)1:4的比例混勻,如(rú)8 μl樣品加入2 μl 5×上樣緩沖液;将蛋白(bái)樣品置于95℃中加熱(rè)5-10分(fēn)鍾;蛋白(bái)樣品加入凝膠加樣孔内電泳。

2.1.3 電泳過程;

在電泳槽的内槽内加入1×Tris-甘氨酸-SDS電泳緩沖液(讓電泳緩沖液漫過加樣孔),輕輕的撥出梳子,用1ml吸頭徹底沖洗加樣孔,随後在電泳槽外槽加入适量的1×Tris-甘氨酸-SDS電泳緩沖液。

SDS-PAGE電泳條件(jiàn)

恒電壓

起始電流(一闆膠)

結束電流(一闆膠)

電泳時間

适用條件(jiàn)

150V

35-40 mA

15-20 mA

55 + min

最佳電壓,最優的分(fēn)辨率

200V

45-55 mA

20-25 mA

45+ min

節省時間

225V

40-50 mA

15-20 mA

35+ min

250V

65-75 mA

20-25 mA

30+ min

300V

70-80 mA

25-35mA

25+ min

最省時間

2.2 非變性電泳(Native PAGE):

2.2.1電泳緩沖液配制:

将5×Tris-甘氨酸電泳緩沖液幹粉(自(zì)備,組份0.96 M 甘氨酸,0.125 M Tris)全部倒入1L燒杯中,加入約900 ml水徹底溶解,用水定容至1 L,即配成5×Tris-甘氨酸電泳緩沖液(此溶液不用調節pH值)。用前再稀釋5倍即配成1×Tris-甘氨酸-SDS電泳緩沖液。

2.2.2 樣品處理(lǐ):融化-混合-上樣

5×非變性非還(hái)原蛋白(bái)上樣緩沖液常溫數分(fēn)鍾解凍後輕輕搖勻,以确保溶液混合均勻;将緩沖液與蛋白(bái)樣品按照(zhào)1:4的比例混勻,如(rú)8 μl樣品加入2 μl 5×上樣緩沖液;蛋白(bái)樣品加入凝膠加樣孔内電泳。注:非變性電泳樣品不能加熱(rè)處理(lǐ)。

2.2.3 電泳過程;

在電泳槽的内槽内加入1×Tris-甘氨酸電泳緩沖液(讓電泳緩沖液漫過加樣孔),輕輕的撥出梳子,用1ml吸頭徹底沖洗加樣孔,随後在電泳槽外槽加入适量的1×Tris-甘氨酸電泳緩沖液。

Native PAGE電泳條件(jiàn)

 

恒電壓

起始電流

結束電流

電泳時間

适用條件(jiàn)

推薦電壓

150V

25-35/闆膠

5-10 mA/闆膠

60 + min

最佳電壓,最優的分(fēn)辨率

. 染色:

1. 将電泳後的PAGE膠取下放(fàng)入塑料容器中,加入适量FastBlue蛋白(bái)染色液或常規考馬斯亮藍染色液(以剛剛覆蓋過膠面爲适),條帶1-2分(fēn)鍾即可(kě)見(jiàn)。

2. 搖床常溫搖動10-15分(fēn)鍾至條帶清晰可(kě)見(jiàn)。

3. 加入适量蒸餾水脫色,期間更換1-2次蒸餾水,搖床常溫搖動10-15分(fēn)鍾至背景幹淨。

4. 觀察保存結果。

 
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