Blue/Clear 非變性凝膠電泳試劑盒

   Blue/Clear Native PAGE Electrophoresis Kit 

● 貨品内容：

● 産品簡介：

Blue/Clear Native PAGE（BN/CN-PAGE）是一種從(cóng)生(shēng)物樣品（質膜，胞漿等）中分(fēn)離(lí)分(fēn)子量10 kD-10 M kD 範圍的蛋白(bái)質複合物的電泳技術(shù)。其原理(lǐ)是用溫和去(qù)污劑(如(rú) DDM，digitonin)将蛋白(bái)複合體(tǐ)從(cóng)細胞膜中以近似天然的狀态分(fēn)離(lí)出來(lái)，Blue Native PAGE （BN-PAGE）是用考馬斯亮藍 G-250 代替 SDS與蛋白(bái)結合而使其帶負電荷，根據蛋白(bái)分(fēn)子量不同在 PAGE膠中得(de)到分(fēn)離(lí)；Clear Native PAGE（CN-PAGE）是電泳緩沖液中不加入任何染料，電泳中始終保持蛋白(bái)的天然電荷和活性狀态，然而，其蛋白(bái)的分(fēn)辨率要低于Blue Native PAGE。另外，BN-PAGE由于考馬斯亮藍G-250存在，使蛋白(bái)都(dōu)覆蓋上負電荷，可(kě)以分(fēn)離(lí)堿性蛋白(bái)（pI＞7）；而CN-PAGE隻适合于酸性蛋白(bái)（pI＜7）的分(fēn)離(lí)。

本産品包括BN/CN-PAGE制膠的所有成分(fēn)，方便使用。可(kě)以用于分(fēn)離(lí)分(fēn)子量在 10 kD-10M kD 的蛋白(bái)複合體(tǐ)，樣品可(kě)以來(lái)于胞漿、細胞總裂解液、細胞膜、線粒體(tǐ)膜和葉綠體(tǐ)膜等。電泳後可(kě)直接用于考染、銀染、Western 雜交、SDS-PAGE電泳、蛋白(bái)純化、蛋白(bái)活性檢測等分(fēn)析實驗，也可(kě)直接用于電洗脫制備蛋白(bái)。

● 運輸和貯存：

本産品常溫運輸；組份按照(zhào)标簽溫度貯存；有效期一年(nián)。

● 使用說(shuō)明：

1. 樣品制備：

   該試劑盒不含樣品制備的相(xiàng)關試劑，根據樣品種類選擇不同提取方法。植物類囊體(tǐ)BN樣品制備可(kě)以選擇植物類囊體(tǐ)膜提取試劑盒（貨号:RTU5002）；動物總蛋白(bái)BN樣品制備可(kě)以選擇動物胞漿活性蛋白(bái)提取試劑盒(貨号:RTD8106)；動物膜蛋白(bái)BN樣品制備可(kě)以選擇動物膜蛋白(bái)提取試劑盒（貨号:RTD8111,RTD8112）；動物線粒體(tǐ)BN樣品制備可(kě)以選擇動物線粒體(tǐ)提取試劑盒（貨号:RTD8115和RTD8116)。

2. 電泳：

2.1 拆開預制膠包裝，将預制膠安裝在合适的電泳槽中。

注：伯樂Mini III或Mini-PROTEAN Tetra Cell，天能VE-180，六一24K系列電泳槽請(qǐng)确保密封條的安裝方向（下圖）。

六一其他(tā)系列，君意東方JY-SCZ2/4，百晶BG-verMINI等電泳槽可(kě)以直接使用預制膠。

不兼容Thermol系列電泳槽。

2.2 準備電泳緩沖液：

将10×BN/CN PAGE電泳緩沖液（幹粉）溶于500 ml滅菌水中，徹底溶解，測定pH應爲7.0左右，不要調節pH。用前稀釋10倍即配成1×BN/CN PAGE電泳緩沖液。

2.2.1 CN-PAGE電泳：

陽極緩沖液和陰極緩沖液均直接使用1×BN/CN PAGE電泳緩沖液進行電泳。

2.2.2 BN-PAGE電泳：

陽極緩沖液使用1×BN/CN PAGE電泳緩沖液，陰極緩沖液按照(zhào)下表配制：

2.3準備樣品：

2.3.1 CN-PAGE電泳：

2.3.2 BN-PAGE電泳：

2.3.2.1 植物類囊體(tǐ)膜蛋白(bái)電泳：

*植物類囊體(tǐ)膜蛋白(bái)電泳中，含去(qù)垢劑樣品中染料加入按照(zhào)以下原則：

植物類囊體(tǐ)樣品中G250終濃度爲去(qù)垢劑終濃度的1/4。例如(rú)樣品中DDM（n-Dodecyl β-D-maltoside，β-DM， n-十二烷基-β-D-麥芽糖苷）終濃度爲2%，則需要G-250終濃度爲0.5%。10 μl蛋白(bái)樣品中需要加5% G-250染料1 μl。

2.3.2.2 動物線粒體(tǐ)BN樣品電泳：

*動物線粒體(tǐ)BN樣品電泳中，含去(qù)垢劑樣品中染料加入按照(zhào)以下原則：

2.4電泳過程；

2.4.1 CN-PAGE電泳：

電泳内外槽均使用1×BN/CN PAGE電泳緩沖液。在電泳槽的内槽内加入1×BN/CN PAGE電泳緩沖液(讓電泳緩沖液漫過加樣孔)，輕輕撥出預制膠梳子，用1ml吸頭沖洗加樣孔3次，随後在電泳槽外槽加入适量的1×BN/CN PAGE電泳緩沖液。

2.4.2 BN-PAGE電泳：

BN-PAGE電泳外槽使用1×BN/CN電泳緩沖液；内槽開始電泳使用的是1×藍色陰極緩沖液，冰浴電泳，等待電泳指示前沿到達凝膠1/3處時，将電泳緩沖液更換爲1×BN/CN電泳緩沖液，繼續後續電泳，因爲過多染料會影(yǐng)響蛋白(bái)在凝膠中的遷移以及蛋白(bái)後續的轉膜實驗。

BN-PAGE電泳條件(jiàn)（一闆膠）

3. 轉膜：

BN-PAGE轉膜必須用PVDF膜，不能用NC膜，因爲NC膜與G-250結合非常緊密，不易去(qù)除。轉膜後PVDF膜上的藍色染料可(kě)以用無水甲醇漂洗去(qù)除。轉膜緩沖液推薦使用10×BN轉膜緩沖液（貨号：BC600P）。

4. 染色：

4.1 将電泳後的PAGE膠取下放(fàng)入塑料容器中，加入适量FastBlue蛋白(bái)染色液或常規考馬斯亮藍染色液（以剛剛覆蓋過膠面爲适），條帶1-2分(fēn)鍾即可(kě)見(jiàn)。

4.2 搖床常溫搖動10-15分(fēn)鍾至條帶清晰可(kě)見(jiàn)。

4.3 加入适量蒸餾水脫色，期間更換1-2次蒸餾水，搖床常溫搖動10-15分(fēn)鍾至背景幹淨。

4.4 觀察保存結果。

5. 實驗示例：

BN-PAGE 3-12% Precast Gel
穩壓120V 1.5 h 1×BN/CN電泳緩沖液 冰浴電泳

BN-PAGE 4-16% Precast Gel
恒壓 120V 2 h 1×BN/CN電泳緩沖液 冰浴電泳

K562 膜蛋白(bái)BN-WB檢測
樣品：膜蛋白(bái)提取樣品用2%DIG和1%DM增溶（ 貨号：RTD8111，動物膜蛋白(bái)提取試劑盒(細胞)） ，
胞漿蛋白(bái)CY做對照(zhào)
電泳：3-12% BN預制膠（貨号：RTD6138-0312），穩壓200V 1×藍色陰極緩沖液至指示前沿距離(lí)膠上沿2/3處，
更換爲無色1×BN/CN PAGE電泳緩沖液，電泳時間共83分(fēn)鍾
膠預處理(lǐ)：膠浸泡于buffer中（12.5mM Tris，2%SDS，20%甘油，50mM DTT pH6.8），微波煮沸20秒，37度15min後轉膜
轉膜：0.45μm PVDF膜，10×BN轉膜緩沖液（貨号：BC600P）稀釋爲1×BN轉膜緩沖液加20%甲醇，
恒流200mA  2小時，未冰浴。
轉膜效果檢測：膜用麗春紅(hóng)染色液染色（貨号：RTD6301）有可(kě)見(jiàn)條帶，膠用FastBlue蛋白(bái)染色液染色
（貨号：RTD6202）幾乎無條帶，證明轉膜成功。膜用無水甲醇清洗5分(fēn)鍾去(qù)除膜上藍色殘餘。
封閉：Western快(kuài)速封閉液（貨号：WR5020）  RT  封閉10 分(fēn)鍾；
圖1 一抗：兔單抗GAPDH 1:10000  RT 60min；羊抗兔IgG-HRP 1:5000 RT 60min，ECL曝光(guāng)6秒
圖2 膜使用Western一抗二抗去(qù)除液（弱堿，溫和型）（貨号：WS1200）37度15min，快(kuài)封10分(fēn)鍾，
一抗：兔Na-K ATPase 1:5000  RT 60min，羊抗兔IgG-HRP 1:5000 RT 60min，ECL曝光(guāng)1秒