4-18%梯度凝膠配制試劑盒

●  貨品内容：

● 産品簡介：

該産品利用聚丙烯酰胺凝膠電泳原理(lǐ)，采用合理(lǐ)設計(jì)的預混合配方和配制流程，配合梯度凝膠生(shēng)成系統（貨号：RT-GZY02），可(kě)以配制得(de)到高質量的4-18%聚丙烯酰胺梯度凝膠。

本試劑盒大(dà)約可(kě)以配制常規大(dà)小（8×10cm）PAGE凝膠，具體(tǐ)數量根據凝膠厚度決定： 1 mm厚度凝膠可(kě)以配制約80-85塊膠。

凝膠緩沖液采用中性pH值，配制好的凝膠4℃可(kě)以穩定貯存一年(nián)。

● 運輸和貯存：

本産品常溫運輸；組份按照(zhào)标簽溫度貯存；有效期一年(nián)。

● 特點：

1. 安全：不用接觸有毒粉末；不用單獨添加有氣味的TEMED；

2. 兼容性廣：制膠溶液中不含SDS，可(kě)用于非變性電泳（Native-PAGE）；

3. 穩定性好：凝膠緩沖液爲中性pH，制備好的凝膠可(kě)以4℃穩定貯存一年(nián)。

● 使用說(shuō)明：

一  凝膠制備：

1.1參照(zhào)梯度混合儀設備（貨号：RT-GZY02）說(shuō)明書(shū)，準備儀器，按照(zhào)圖示将系統連接：

将帶接頭的矽膠管一端插入到梯度混合儀側方插口（可(kě)以選擇連接藍色閥門(mén)），另一端與蠕動泵下方矽膠管接頭連接（蠕動泵溶液方向是一般爲下進上出）。藍色閥門(mén)插入到多闆制膠器接口，将不帶接頭矽膠管截取适當長度一端與藍色閥門(mén)連接，另一端與蠕動泵上方矽膠管接頭連接。藍色閥門(mén)旋鈕方向與矽膠管平行爲開啓，旋轉至與矽膠管垂直方向爲關閉。梯度混合儀左側杆狀旋鈕與地面垂直爲開啓，旋轉與水平面有夾角爲關閉。

1.2 蠕動泵使用方法：

按照(zhào)圖示調節蠕動泵。灌裝速度不要太快(kuài)。

1.3 多闆制膠器使用：

使用前将多闆制膠器填充塊兩側的保護膜揭掉；

準備好制膠用的厚玻璃闆和短(duǎn)玻璃闆。

将厚玻璃闆和短(duǎn)玻璃闆對齊并在短(duǎn)玻璃闆前方放(fàng)一張分(fēn)隔片，此爲一套玻闆三明治組合；

将多闆制膠器放(fàng)倒，以厚玻闆在下的方式放(fàng)入玻闆三明治組合，1.0厚度玻璃闆最多可(kě)放(fàng)12套；

插入密封擋闆，在最後一塊填充塊或者最後一組玻闆組合前插入适量的分(fēn)隔片以保證玻闆和填充塊壓緊，然後擰緊螺絲。

在密封擋闆下面小孔插入閥門(mén)，并打開閥門(mén)（閥門(mén)旋鈕與矽膠管平行爲開啓）。

1.4 配制溶液：

按照(zhào)下表配制溶液，以制備12闆 4-18% 厚度1.0mm梯度膠爲例：

梯度混合儀加入溶液前，首先把梯度混合儀閥門(mén)關閉（旋轉旋鈕與水平面有夾角爲關閉）。

加入溶液原則：左槽（靠近旋鈕閥門(mén)）加高濃度溶液；右槽（靠近出口）加低濃度溶液。

将磁力攪拌子放(fàng)入右槽中，打開磁力攪拌器（自(zì)備），轉動轉子。

1.5 灌膠操作(zuò)：

重要步驟：

灌膠前事(shì)先檢查: 梯度混合儀旋鈕是否爲開啓狀态(杆狀旋鈕與水平面垂直爲開啓):應爲開啓

磁力攪拌子是否轉動：應爲轉動

蠕動泵是否爲關閉狀态：應爲關閉

多闆制膠器閥門(mén)是否爲開啓狀态(藍色旋鈕與矽膠管平行爲開啓):應爲開啓

檢查無誤後，打開蠕動泵，使用a模式，調節數字爲25，開始灌膠操作(zuò)。至多闆制膠器中的溶液至頂部接近溢出時，首先關閉多闆制膠器藍色閥門(mén)（旋鈕與矽膠管垂直爲關閉）；

暫停蠕動泵；迅速在梯度混合儀左右槽中加滿蒸餾水，打開蠕動泵，徹底沖洗管道。

注：此步驟非常重要，不立即徹底沖洗，殘餘的凝膠會堵塞梯度混合儀和管道。

仔細插入梳子，盡量一次成功，避免産生(shēng)氣泡。

37℃ 恒溫箱中凝固2-3小時。

注：凝固溫度非常關鍵，當室内溫度低于18度時，凝固時間會很長。

1.6 拆膠：

待凝膠凝固好後，打開多闆制膠器螺絲，用膠鏟在兩闆之間輕輕撬動，注意不要誤撬玻璃短(duǎn)闆，否則将導緻玻璃闆和膠之間産生(shēng)氣泡，使得(de)凝膠無法使用。用水将每闆凝膠沖洗幹淨，自(zì)封袋封好，加入2 ml  1×電泳緩沖液保持潤濕，4℃水平放(fàng)置。

二  電泳：

2.1 SDS-PAGE變性電泳：

2.1.1電泳緩沖液配制：

将5×Tris-甘氨酸-SDS電泳緩沖液幹粉（自(zì)備，組份0.96 M 甘氨酸，0.125 M Tris，0.5% SDS）全部倒入1L燒杯中，加入約900 ml水徹底溶解，用水定容至1 L，即配成5×Tris-甘氨酸電泳緩沖液（此溶液不用調節pH值）。用前再稀釋5倍即配成1×Tris-甘氨酸-SDS電泳緩沖液。

2.1.2 樣品處理(lǐ)：融化-混合-變性-上樣

5×MonoColor蛋白(bái)上樣緩沖液常溫數分(fēn)鍾解凍後輕輕搖勻，以确保溶液混合均勻；将緩沖液與蛋白(bái)樣品按照(zhào)1：4的比例混勻，如(rú)8 μl樣品加入2 μl 5×上樣緩沖液；将蛋白(bái)樣品置于95℃中加熱(rè)5-10分(fēn)鍾；蛋白(bái)樣品加入凝膠加樣孔内電泳。

2.1.3 電泳過程；

在電泳槽的内槽内加入1×Tris-甘氨酸-SDS電泳緩沖液(讓電泳緩沖液漫過加樣孔)，輕輕的撥出梳子，用1ml吸頭徹底沖洗加樣孔，随後在電泳槽外槽加入适量的1×Tris-甘氨酸-SDS電泳緩沖液。

表三 SDS-PAGE電泳條件(jiàn)

2.2 非變性電泳（Native PAGE）：

2.2.1電泳緩沖液配制：

将5×Tris-甘氨酸電泳緩沖液幹粉（自(zì)備，組份0.96 M 甘氨酸，0.125 M Tris）全部倒入1L燒杯中，加入約900 ml水徹底溶解，用水定容至1 L，即配成5×Tris-甘氨酸電泳緩沖液（此溶液不用調節pH值）。用前再稀釋5倍即配成1×Tris-甘氨酸-SDS電泳緩沖液。

2.2.2 樣品處理(lǐ)：融化-混合-上樣

5×非變性非還(hái)原蛋白(bái)上樣緩沖液常溫數分(fēn)鍾解凍後輕輕搖勻，以确保溶液混合均勻；将緩沖液與蛋白(bái)樣品按照(zhào)1：4的比例混勻，如(rú)8 μl樣品加入2 μl 5×上樣緩沖液；蛋白(bái)樣品加入凝膠加樣孔内電泳。注：非變性電泳樣品不能加熱(rè)處理(lǐ)。

2.2.3 電泳過程；

在電泳槽的内槽内加入1×Tris-甘氨酸電泳緩沖液(讓電泳緩沖液漫過加樣孔)，輕輕的撥出梳子，用1ml吸頭徹底沖洗加樣孔，随後在電泳槽外槽加入适量的1×Tris-甘氨酸電泳緩沖液。

表四 Native PAGE電泳條件(jiàn)

三. 染色：

1. 将電泳後的PAGE膠取下放(fàng)入塑料容器中，加入适量FastBlue蛋白(bái)染色液或常規考馬斯亮藍染色液（以剛剛覆蓋過膠面爲适），條帶1-2分(fēn)鍾即可(kě)見(jiàn)。

2. 搖床常溫搖動10-15分(fēn)鍾至條帶清晰可(kě)見(jiàn)。

3. 加入适量蒸餾水脫色，期間更換1-2次蒸餾水，搖床常溫搖動10-15分(fēn)鍾至背景幹淨。

4. 觀察保存結果。