6%Tris-醋酸-SDS-PAGE電泳試劑盒（變性電泳，手灌膠）
|
貨号
|
名稱
|
規格
|
|
RTD6162
|
6%Tris-醋酸-SDS-PAGE電泳試劑盒（變性電泳，手灌膠）
|
10次
|
● 産品組成：
|
貨号
|
名稱
|
規格
|
貯存
|
|
RTD6162-UA
|
上層膠溶液A
|
10
ml
|
4℃
|
|
RTD6162-UB
|
彩色上層膠溶液B
|
10
ml
|
4℃
|
|
RTD6162-LA06
|
下層膠溶液A 6%
|
30
ml
|
4℃
|
|
RTD6162-LB
|
下層膠溶液B
|
30
ml
|
4℃
|
|
RTD6162-SP
|
改良型促凝劑
|
8
ml
|
4℃
(配制後-20℃貯存)
|
|
TA1510
|
400×抗氧化劑
|
15
ml
|
4℃
(配制後-20℃貯存)
|
|
TA050
|
10×Tris-醋酸-SDS電泳緩沖液(變性電泳,溶液型）
|
500
ml
|
RT
|
|
PL080-01
|
5×MonoClolor蛋白(bái)上樣緩沖液 (變性，還(hái)原)
|
1 ml
|
-20℃
|
|
RTD6202
|
FastBlue蛋白(bái)快(kuài)速染色液
|
500 ml
|
RT
|
|
TA5030P
|
10×Tris-醋酸轉膜緩沖液（濕轉，粉末型）
|
500
ml
|
RT
|
|
|
說(shuō)明書(shū)
|
一份
|
-
|
● 産品簡介：
Tris-醋酸-SDS-PAGE凝膠電泳适合于分(fēn)離(lí)高分(fēn)子量蛋白(bái)，可(kě)以有效分(fēn)離(lí)50-500 kD範圍内蛋白(bái)；電泳體(tǐ)系呈中性，能有效提高蛋白(bái)的穩定性；電泳緩沖體(tǐ)系中加入抗氧化劑，整個電泳過程都(dōu)在還(hái)原條件(jiàn)下進行，有效防止二硫鍵的形成。
該試劑盒包含凝膠制備、蛋白(bái)上樣、蛋白(bái)電泳、蛋白(bái)染色及轉膜所需的全部試劑。試劑盒配套的制膠溶液，可(kě)以配制10闆厚度1mm凝膠（面積8×10 cm），分(fēn)離(lí)膠濃度爲6%，可(kě)以有效分(fēn)離(lí)50-500 kD範圍内蛋白(bái)。配好的凝膠濃縮膠爲紅(hóng)色，方便上樣。本試劑盒用于蛋白(bái)變性還(hái)原電泳，不适用于蛋白(bái)非變性電泳。
按照(zhào)一次實驗電泳一闆凝膠計(jì)算，本試劑盒可(kě)以使用10次。
● 貯存、運輸及效期：
按照(zhào)标簽溫度貯存；試劑盒常溫運輸；有效期一年(nián)。
● 使用說(shuō)明：
一. 實驗準備：
1.1 改良型促凝劑爲幹粉，用前加入8 ml超純水震蕩徹底溶解，适量分(fēn)裝後取一管使用。溶解後的促凝劑-20℃貯存。
1.2 400×抗氧化劑爲幹粉，用前加入15 ml超純水震蕩徹底溶解後使用，已經溶解的400×抗氧化劑-20℃貯存。
二. 凝膠配制：
2.1參照(zhào)凝膠模具說(shuō)明書(shū)，裝配好凝膠模具。
2.2 根據下表配制凝膠：
|
下層膠配方
|
上層膠配方
|
|
膠厚度
|
下層膠溶液B
|
下層膠溶液A
|
改良型促凝劑
|
膠厚度
|
彩色上層膠溶液B
|
上層膠溶液A
|
改良型促凝劑
|
|
0.75 mm
|
2 ml
|
2 ml
|
40 μl
|
0.75 mm
|
0.5 ml
|
0.5 ml
|
10 μl
|
|
1.0 mm
|
2.5 ml
|
2.5 ml
|
50 μl
|
1.0 mm
|
0.75 ml
|
0.75 ml
|
15 μl
|
|
1.5 mm
|
4 ml
|
4 ml
|
80 μl
|
1.5 mm
|
1 ml
|
1 ml
|
20 μl
|
2.2.1 取等體(tǐ)積下層膠溶液B 和下層膠溶液A ，各
2.0/2.5/4.0 ml，混勻；
2.2.2混合溶液中加入 40/50/80 μl的改良型促凝劑，輕輕混勻，将混勻後的溶液注入制膠玻璃闆中，使液面和短(duǎn)玻璃闆上沿之間的距離(lí)比梳齒長0.5 cm即可(kě)；
注意：此溶液爲過量，請(qǐng)勿全部注入。
2.2.3 沿玻璃闆緩慢(màn)加入适量滅菌水或無水乙醇覆蓋于下層膠之上，待下層膠凝固後，倒去(qù)上層水或乙醇；
注意：當水（乙醇）和膠之間有一條折射線時，說(shuō)明膠已凝固；25℃時5-10分(fēn)鍾可(kě)以聚合。
2.2.4 取等體(tǐ)積彩色上層膠溶液B和上層膠溶液A ，各
0.5/0.75/1.0 ml，混勻；
2.2.5向混合溶液中加入 10/15/20 μl 的改良型促凝劑，輕輕混勻，插入梳齒；
2.2.6 待上層膠凝固後 （約20-40
min），拔去(qù)梳齒即可(kě)用于電泳。
注：凝膠的聚合時間與環境溫度有關。夏天溫度較高時，聚合較快(kuài)；冬天氣溫低時，聚合時間會延長。
上層膠25℃ 20-25分(fēn)鍾可(kě)以聚合；18℃ 35-40分(fēn)鍾可(kě)以聚合。
三. 電泳：
3.1 準備1×電泳緩沖液：
|
總體(tǐ)積
|
1000
ml
|
|
10×Tris-醋酸-SDS電泳緩沖液
|
100 ml
|
|
超純水
|
900 ml
|
3.1.1 外槽緩沖液：取适量體(tǐ)積1×電泳緩沖液用于外槽緩沖液。
3.1.2 内槽緩沖液：200 ml 1×電泳緩沖液中加0.5 ml 400×抗氧化劑，混合均勻後用于内槽緩沖液。
3.2準備上樣樣品：
注：表格以配制10 μl樣品爲例，其他(tā)體(tǐ)積按照(zhào)比例調整。
|
|
總體(tǐ)積10 μl
|
|
組份
|
還(hái)原樣品
|
|
蛋白(bái)樣品
|
x μl
|
|
5×MonoClolor蛋白(bái)上樣緩沖液 (變性，還(hái)原)
|
2 μl
|
|
超純水
|
補至10 μl
|
|
|
95℃ 10分(fēn)鍾
|
3.3電泳過程；
在電泳槽的内槽加入内槽緩沖液（已加入抗氧化劑），讓電泳緩沖液漫過加樣孔，輕輕的撥出梳子，用1ml吸頭沖洗加樣孔3次；随後在電泳槽外槽加入适量的外槽緩沖液（不用添加抗氧化劑）。上樣，電泳。
|
恒電壓
|
起始電流
|
結束電流
|
電泳時間
|
|
200
V
|
65-75 mA/闆膠
|
35-55 mA/闆膠
|
50+min
|
|
注：冰浴電泳（可(kě)選）
|
四. 染色：
注：如(rú)果隻是觀察蛋白(bái)的分(fēn)離(lí)情況，對凝膠進行染色。如(rú)果要後續進行WB實驗，凝膠不要染色，進行步驟五。
4.1 将電泳後的PAGE膠取下放(fàng)入塑料容器中，加入适量FastBlue蛋白(bái)染色液（以剛剛覆蓋過膠面爲适），搖床常溫搖動，條帶5-10分(fēn)鍾即可(kě)見(jiàn)（蛋白(bái)含量高于1
μg條帶）。
4.2 搖床常溫繼續搖動15-30分(fēn)鍾至條帶清晰可(kě)見(jiàn)。
4.3 加入适量蒸餾水脫色，期間更換1-2次蒸餾水，搖床常溫搖動10-15分(fēn)鍾至背景幹淨。
4.4 觀察保存結果。
五. 轉膜：
5.1 轉印膜選擇：
Tris-醋酸凝膠轉膜可(kě)以使用NC膜和PVDF膜，需要選擇0.45 μm孔徑。PVDF膜使用前注意需要用甲醇潤濕活化。
5.2 10×Tris-醋酸轉膜緩沖液（溶液型）配制：
将10×Tris-醋酸轉膜緩沖液（濕轉，粉末型）粉末溶解于500 ml超純水中，即配成500 ml 10×Tris-醋酸轉膜緩沖液（溶液型），不要調節pH，pH~7.2。
5.3 準備1×轉膜緩沖液：
|
|
|
1×即用型轉膜緩沖液 配制量 1升
|
|
|
10×Tris-醋酸轉膜緩沖液(溶液型)
|
100
ml
|
|
20-80 kD蛋白(bái)
|
無水甲醇
|
10%
|
|
SDS
|
0.05%
|
|
＞80 kD蛋白(bái)
|
無水甲醇
|
10%（NC膜）
0-5%（PVDF膜）
|
|
SDS
|
0.1%
|
|
|
超純水
|
定容至1升，不要調節pH，pH~7.2
|
注：甲醇和SDS在轉膜中有拮抗作(zuò)用。甲醇使蛋白(bái)更加結合在膜上，而SDS讓蛋白(bái)更加離(lí)開膜。因此對大(dà)蛋白(bái)轉膜來(lái)說(shuō)，多加SDS，少加甲醇；而對小蛋白(bái)轉膜，多加甲醇，少加SDS。
5.4 轉膜條件(jiàn)：
高分(fēn)子量蛋白(bái)建議(yì)濕轉。以下轉膜條件(jiàn)僅供參考，客戶針對自(zì)己的目的蛋白(bái)，最好經過1-2次預實驗後，确定最佳的轉膜條件(jiàn)。
|
膜孔徑
|
蛋白(bái)大(dà)小
|
穩流
|
建議(yì)時間
|
降溫措施
|
|
0.45 μm
|
50-200 kD
|
350 mA
|
~60分(fēn)鍾
|
需要
|
|
0.45 μm
|
高于200
kD
|
350 mA
|
~2-3小時
|
需要
|
六. 實驗示例：
凝膠：6%Tris醋酸手灌膠
電泳：1×TAS 200V 70-42mA 55min；内槽加抗氧化劑
染色：FastBlue蛋白(bái)染色液染色 15 分(fēn)鍾
樣品：4K-BME-細菌裂解物；K562-懸浮細胞RIPA提取總蛋白(bái)