快(kuài)速蛋白(bái)高靈敏度染色試劑盒

● 貯存、運輸及效期：

常溫保存；常溫運輸；開封後一年(nián)有效。

● 産品簡介

快(kuài)速蛋白(bái)高靈敏度試劑盒是一種快(kuài)速簡單、可(kě)用于SDS-PAGE或非變性PAGE等蛋白(bái)分(fēn)離(lí)後染色的試劑盒。本試劑盒也可(kě)以用于2D凝膠的染色，并且染色後兼容後續的質譜檢測。本試劑盒隻需約90分(fēn)鍾内可(kě)以完成凝膠的染色。對于BSA蛋白(bái)，檢測靈敏度可(kě)以達到0.3 ng蛋白(bái)。

本試劑盒可(kě)足夠用于25塊常規的8×10 cm凝膠的染色。

說(shuō)明書(shū)後附有實驗記錄表格，方便記錄實驗步驟。

● 産品組成：

● 注意事(shì)項：

1. 由于該方法染色非常靈敏，操作(zuò)時請(qǐng)注意盡量使用高純度的水，并确保所使用的器皿非常清潔，最好使用潔淨的玻璃器皿。操作(zuò)時必須戴手套，避免皮膚和凝膠直接接觸。

2. 需自(zì)備乙醇、冰醋酸及MilliQ級純水或雙蒸水。

3. 下述使用說(shuō)明中各種溶液的使用量适用于大(dà)小爲8×10 cm厚度爲0.75-1 mm的凝膠。對于更大(dà)的凝膠，各種溶液的使用量需按凝膠面積的比例放(fàng)大(dà)；對于更厚的凝膠，作(zuò)用時間需按照(zhào)厚度的比例适當延長10-20分(fēn)鍾。

4. 本說(shuō)明書(shū)所指的常溫溫爲20-25℃，操作(zuò)溫度較低時由于溶液的擴散能力下降，各步驟需适當延長時間。

5. 基本顯色液(10×)在4℃低溫貯存時可(kě)能會出現沉澱，可(kě)在37℃水浴中溶解，并充分(fēn)混勻後使用。

● 使用方法：

一. 固定步驟：

1.1 漂洗：電泳結束後，凝膠中加入100 ml雙蒸水中漂洗5分(fēn)鍾，重複漂洗1次，去(qù)除凝膠表面的電泳緩沖液。

1.2 固定：取漂洗後的凝膠放(fàng)入約100 ml固定液中，在搖床上常溫搖動20分(fēn)鍾，搖動速度爲60-70 rpm。固定40分(fēn)鍾以上甚至過夜可(kě)以進一步降低背景。

固定液的配制 配制量100 ml

1.3 30%乙醇洗滌：

棄固定液，加入100 ml 30%乙醇，在搖床上常溫搖動10分(fēn)鍾，搖動速度爲60-70 rpm。

30%乙醇的配制：

70 ml MilliQ級純水或雙蒸水中加入30 ml乙醇，混勻後即成100 ml 30%乙醇。

1.4 水漂洗：

棄30%乙醇，加入100 ml MilliQ級純水或雙蒸水，在搖床上常溫搖動5分(fēn)鍾，搖動速度爲60-70 rpm；重複漂洗一次。

二. 增敏步驟：

2.1 棄水，加入100 ml增敏液(1×)，在搖床上常溫搖動2分(fēn)鍾，搖動速度爲60-70 rpm。

增敏液(1×)的配制：

注：增敏液(1×)配制後需在2小時内使用。

2.2 水漂洗(共2次)：

棄原有溶液，加入200 ml MilliQ級純水或雙蒸水，在搖床上常溫搖動1分(fēn)鍾，搖動速度爲60-70 rpm。 重複此步驟一次。

三. 染色步驟：

3.1 染色：

棄水，加入100 ml染色溶液(1×)，在搖床上常溫搖動10分(fēn)鍾，搖動速度爲60-70 rpm。 染色過程中，凝膠會呈微微黃(huáng)色。

染色溶液(1X)的配制：

注：染色溶液(1X)配制後需在2小時内使用。

3.2 水洗滌：

棄染色溶液，加入100 ml MilliQ級純水或雙蒸水，在搖床上常溫搖動1-1.5分(fēn)鍾，搖動速度爲60-70rpm。

注意：水洗滌的時間不能超過1.5分(fēn)鍾。

四. 顯色步驟：

棄水，加入100 ml顯色液，在搖床上常溫搖動3-7分(fēn)鍾，直至出現比較理(lǐ)想的預期蛋白(bái)條帶，搖動速度爲60-70 rpm。

顯色液的配制 配制量100 ml

注：顯色加速液(2000×)有刺激性氣味，建議(yì)在通風(fēng)櫥内操作(zuò)；

顯色液配制後需在20分(fēn)鍾内使用。

五. 終止步驟：

5.1 漂洗：棄顯色液，加入100 ml雙蒸水在搖床上常溫搖動2分(fēn)鍾，漂洗掉凝膠上殘留的顯色液。

5.2 終止染色：

棄顯色液，加入100 ml終止液(1×)，在搖床上常溫搖動10分(fēn)鍾，搖動速度爲60-70 rpm。終止時有氣體(tǐ)産生(shēng)屬正常現象，産生(shēng)的氣體(tǐ)爲二氧化碳。

終止液(1×)的配制：

注：終止液(1×)配制後應當天使用。

5.3 水洗滌：

棄終止液，加入100 ml MilliQ級純水或雙蒸水，在搖床上常溫搖動5分(fēn)鍾，搖動速度爲60-70 rpm。

六. 保存：

可(kě)在MilliQ級純水或雙蒸水中保存或采用适當的方式制備成幹膠。

● 常見(jiàn)問(wèn)題：

一.  背景太深：

1.1. 步驟四顯色時間過長。通常顯色反應會在10分(fēn)鍾内結束，顯色反應時間過長會導緻背景很深。

1.2. 洗滌不充分(fēn)。洗滌時間過短(duǎn)，或洗滌液加入的量不足，或者容器過于狹小導緻搖動時溶液不易充分(fēn)混合，或搖動速度過慢(màn)，導緻混勻不充分(fēn)。請(qǐng)按照(zhào)說(shuō)明書(shū)的建議(yì)确保各種溶液的用量和作(zuò)用時間，搖床的推薦速度爲60-70 rpm。

1.3 步驟1.2中凝膠中原有的緩沖液等未在固定步驟中去(qù)除幹淨。一方面需确保固定的時間和固定液的用量，另一方面對于不是最常用的Bis-Tris系統的凝膠需要更長的固定時間以充分(fēn)去(qù)除凝膠中的原有緩沖成分(fēn)，以降低背景。

1.4 水的純度太低。需使用大(dà)于16 MΩ·cm的高純度水。

二.  蛋白(bái)條帶非常淺：

2.1 蛋白(bái)的半胱氨酸(Cysteine)殘基的含量特别低或幾乎沒有。半胱氨酸殘基的存在對于染色非常重要，半胱氨酸殘基的含量過低會導緻檢測靈敏度下降。

2.2 步驟3.2染色後水洗滌時間過長。在染色溶液染色時需嚴格控制水洗滌的時間，水洗滌的時間不能超過1.5分(fēn)鍾，否則會導緻過多的顯色離(lí)子被洗去(qù)，導緻檢測靈敏度下降。

2.3 上樣量不足。本試劑盒檢測BSA的靈敏度可(kě)以達到0.3 ng，對于不同的蛋白(bái)檢測靈敏度可(kě)能不同。對于一些蛋白(bái)可(kě)能需要大(dà)于1 ng的蛋白(bái)量才能被檢測到。

2.4步驟1.3和1.4的洗滌不夠充分(fēn)。導緻少量乙酸殘留，影(yǐng)響後續檢測。确保30%乙醇洗滌和水洗滌的用量和時間，可(kě)以适當延長洗滌時間。

三.  凝膠上出現小點或其它非蛋白(bái)的痕迹：

3.1 凝膠沒有充分(fēn)被溶液浸沒。請(qǐng)注意選擇大(dà)小合适的容器，并加入足量的各種溶液，同時需保持适當的混勻速度确保凝膠可(kě)以被溶液浸沒。

3.2 用于染色的容器沒有充分(fēn)洗滌幹淨。容器需先用洗滌劑充分(fēn)洗滌，随後用自(zì)來(lái)水充分(fēn)沖洗，最後用高純度水再洗滌數次。該容器最好能專用于染色，并注意避免各種可(kě)能的蛋白(bái)污染。

3.3 指紋或其它壓痕。請(qǐng)注意戴手套操作(zuò)，切勿直接接觸皮膚。操作(zuò)時請(qǐng)注意盡量勿擠壓、

折疊或摩擦凝膠。

3.4 有金屬物質接觸凝膠。金屬物質例如(rú)金屬鑷子等接觸凝膠會出現非特異性痕迹。

四.  在60-70 kD處出現一片模糊的蛋白(bái)染色背景：

皮膚上脫落的角蛋白(bái)(keratin)污染了蛋白(bái)樣品。一方面需注意戴手套操作(zuò)，另一方面需注意盛放(fàng)蛋白(bái)樣品的容器蓋子盡量不要敞開，甚至在取放(fàng)蛋白(bái)樣品時在超淨台内進行以避免可(kě)能的角蛋白(bái)污染。

五. 在凝膠的上半部分(fēn)出現黃(huáng)色背景：

5.1 樣品使用了含有DTT的上樣緩沖液。換用含有其它還(hái)原試劑如(rú)β-巯基乙醇的上樣緩沖液。

5.2 采用Tris-Glycine-SDS電泳體(tǐ)系。Tris-Glycine-SDS電泳體(tǐ)系中的Glycine會導緻

背景凝膠的頂端出現輕微的黃(huáng)色背景。

● 實驗記錄表格

實驗日(rì)期：

實驗示例：