植物總蛋白(bái)提取試劑盒-通用型

Plant Total Protein Isolation Kit（for general use）

● 産品貨号及規格

● 産品簡介

本産品能夠有效裂解各種植物器官（如(rú)葉片，根，莖，果實，種子，花），去(qù)除各種植物樣品（包括富含次生(shēng)代謝物質和多糖多酚的植物）中常見(jiàn)的污染，如(rú)多糖，多酚，脂類，色素，次生(shēng)代謝物等，得(de)到的高純度蛋白(bái)樣品，可(kě)以用于SDS-PAGE凝膠電泳，Western印迹分(fēn)析以及雙向電泳（2D電泳）。

該試劑盒含有除丙酮外的其他(tā)所有試劑，使用方便，能在3小時内得(de)到高純度的蛋白(bái)樣品。

按照(zhào)每次提取使用0.7ml試劑B計(jì)算，該試劑盒可(kě)以至少使用20次。

●  使用方法：

實驗準備材料：

液氮；研缽；1.5ml離(lí)心管；一次性注射器；丙酮；80%丙酮；70℃水浴鍋；幹浴器；冷(lěng)凍離(lí)心機(jī)；制冰機(jī)；渦旋振蕩器。

一. 樣品破碎：

1.1 取植物樣本，在液氮條件(jiàn)下，用研缽充分(fēn)研磨成粉末。

關鍵步驟：此步驟非常重要，樣本研磨越細越好，研磨不徹底會導緻蛋白(bái)濃度偏低。

二. 沉澱雜質：

2.1 取1.5 ml離(lí)心管，加入1 ml即用型試劑A（按照(zhào)下表配制），迅速将約0.1克粉末加入其中，漩渦混勻，RT 放(fàng)置5分(fēn)鍾。

關鍵步驟：樣品粉末量不能超過0.1克，否則将導緻蛋白(bái)提取得(de)率和純度大(dà)大(dà)降低。

即用型試劑A-樣本雜質去(qù)除劑配制

2.212000g4℃離(lí)心5分(fēn)鍾，去(qù)除上清，保留沉澱。

注：觀察沉澱顔色，如(rú)沉澱顔色爲綠色，繼續步驟2.3；如(rú)沉澱顔色爲淺色或白(bái)色，直接進行步驟2.4。

2.3 沉澱中加入1 ml即用型試劑A，漩渦混勻，RT放(fàng)置5分(fēn)鍾，12000g4℃離(lí)心5分(fēn)鍾。

2.4 沉澱中加入1 ml 預冷(lěng)的丙酮（自(zì)備，試劑盒不提供）和10 μl DTT溶液，漩渦震蕩（此時溶液狀态應爲白(bái)色懸液），徹底重懸，12000g4℃離(lí)心5分(fēn)鍾，去(qù)除上清，收集沉澱。

2.5 快(kuài)甩離(lí)心數秒，殘留上清用移液器徹底吸棄，沉澱物通風(fēng)晾幹1-2分(fēn)鍾至沉澱幹燥。

 關鍵步驟：沉澱不能過分(fēn)幹燥，否則會影(yǐng)響以下步驟蛋白(bái)的溶解性。

三. 蛋白(bái)粗提：

3.1 蛋白(bái)沉澱中加入0.7 ml 即用型試劑B（按照(zhào)下表配制），漩渦震蕩，徹底重懸沉澱（此時溶液狀态爲淡藍色的懸浮溶液）；70℃水浴1小時，間歇混勻。

即用型試劑B-植物蛋白(bái)提取緩沖液配制：

3.212000g4℃離(lí)心10分(fēn)鍾，小心取上清（通常可(kě)取600 μl，溶液爲淡藍色）于1.5ml離(lí)心管中，不要吸取沉澱。

注：此步驟得(de)到的蛋白(bái)溶液可(kě)以進行大(dà)多數蛋白(bái)實驗，如(rú)WB。如(rú)要進行雙向電泳（2D電泳）實驗，繼續以下步驟。

四. 蛋白(bái)純化：

4.1 加入與上清等體(tǐ)積的試劑C（注：試劑C上層爲保護相(xiàng)，應該吸取下部的淡黃(huáng)色液體(tǐ)），劇(jù)烈颠倒震蕩後常溫放(fàng)置1-2分(fēn)鍾，12000gRT 離(lí)心5分(fēn)鍾，溶液分(fēn)成兩層，上層溶液爲藍色，蛋白(bái)位于下層溶液中。

注：試劑C有腐蝕性，請(qǐng)在通風(fēng)櫥内操作(zuò)，注意防護。

4.2 用一次性注射器小心吸取下層溶液（通常可(kě)取350 μl）于1.5 ml離(lí)心管中，加入等體(tǐ)積試劑D，劇(jù)烈颠倒混勻，12000gRT 離(lí)心5分(fēn)鍾，蛋白(bái)位于上層溶液中，收集上層溶液（通常可(kě)取150-200 μl）于1.5ml離(lí)心管中。

五. 蛋白(bái)沉澱：

5.1 蛋白(bái)溶液中加入5倍體(tǐ)積溶液E（注意是否已經按照(zhào)标簽所示加入甲醇），颠倒混勻，此時可(kě)見(jiàn)有絮狀沉澱生(shēng)産，-20℃ 沉澱30分(fēn)鍾。

    注：微量蛋白(bái)的提取可(kě)以-20℃過夜沉澱。

5.212000g4℃離(lí)心10分(fēn)鍾，收集蛋白(bái)沉澱，去(qù)除上清。

注：正常的蛋白(bái)沉澱接近無色，如(rú)顔色爲褐色或淡黃(huáng)色說(shuō)明蛋白(bái)不純，不能用于雙向電泳實驗。重複步驟3.1-5.2，直至蛋白(bái)沉澱接近無色。

5.3 沉澱中加入1ml 溶液E（注意是否已經按照(zhào)标簽所示加入甲醇），徹底重懸沉澱，12000rpm4℃離(lí)心5分(fēn)鍾，棄上清。

5.4 沉澱中加入1ml預冷(lěng)的80%丙酮（自(zì)備，試劑盒不提供）和10 μl DTT，徹底重懸沉澱，12000g4℃離(lí)心5分(fēn)鍾，棄上清。

5.5 快(kuài)甩離(lí)心數秒，殘留上清移液器徹底吸棄，沉澱物通風(fēng)晾幹1-2分(fēn)鍾至沉澱幹燥。

   關鍵步驟：沉澱不能過分(fēn)幹燥，否則不好溶解。

六. 蛋白(bái)溶解：

6.1 沉澱中溶解于适量PBS溶液或者适當體(tǐ)積樣品緩沖液溶解，-20℃或-80℃貯存。

注：① 如(rú)進行雙向電泳，樣品溶于雙向電泳樣品緩沖液中；如(rú)進行單向電泳，樣品溶于1×SDS-PAGE 上樣緩沖液中。

 ② 由于提取過程中使用了DTT，爲了避免DTT對蛋白(bái)濃度測定的幹擾，蛋白(bái)定量時盡量選擇Bradford方法。