柱式動物胞漿蛋白(bái)提取試劑盒(細胞樣品,非變性提取,不含去(qù)垢劑)
(Column Animal
Cells Native Protein Extraction Kit，Detergent-free)
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貨号
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名稱
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規格
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RTD8106
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柱式動物胞漿蛋白(bái)提取試劑盒(細胞樣品,非變性提取,不含去(qù)垢劑)
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50次
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● 産品簡介
蛋白(bái)提取過程中經常使用去(qù)垢劑裂解細胞，如(rú)NP-40，Triton
X-100，SDS等。然而這些去(qù)垢劑會對提取的蛋白(bái)後續功能研究産生(shēng)影(yǐng)響。如(rú)去(qù)垢劑會影(yǐng)響蛋白(bái)的熒光(guāng)标記；高濃度的去(qù)垢劑會影(yǐng)響蛋白(bái)互作(zuò)研究；陰離(lí)子去(qù)垢劑如(rú)SDS提取得(de)到變性蛋白(bái)，不利于蛋白(bái)活性研究；含去(qù)垢劑的蛋白(bái)樣品能與考馬斯亮藍G-250結合，影(yǐng)響Blue
Native電泳的分(fēn)離(lí)效果。
本試劑盒采用不含去(qù)垢劑的裂解緩沖液，在低滲透壓條件(jiàn)下，使細胞充分(fēn)膨脹，然後結合離(lí)心柱離(lí)心，有效破壞細胞膜，釋放(fàng)出細胞内蛋白(bái)，然後通過離(lí)心得(de)到活性蛋白(bái)。另外，裂解緩沖液中也不含有還(hái)原劑如(rú)DTT和BME等，能有效保持蛋白(bái)的天然結構。
對于細胞樣品，如(rú)果每個樣品的數量爲5×106個細胞，本試劑盒可(kě)以抽提50個樣品。
使用該産品提取的蛋白(bái)可(kě)以用于普通非變性電泳（Laemmli系統）（貨号：RTD6130，RTD6135）或Blue
Native系統（貨号：RTD6140）。
注：由于提取緩沖液的适用性，本試劑盒主要提取得(de)到的是胞漿内的可(kě)溶性蛋白(bái)，對細胞膜蛋白(bái)，細胞器蛋白(bái)，細胞核蛋白(bái)提取效率不高，不建議(yì)使用。
● 産品組成
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産品編号
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名稱
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規格
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貯存
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RTD8106-01
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非變性裂解緩沖液
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25 ml
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4℃
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CD-50
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離(lí)心柱套裝
（包含離(lí)心柱和2ml連蓋收集管）
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50個
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RT
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● 貯存、效期及運輸：
按照(zhào)标簽溫度貯存；有效期一年(nián)；常溫運輸。
● 用前必讀(dú)：
1.
離(lí)心機(jī)請(qǐng)調整成RCF/g模式，按照(zhào)離(lí)心力設置離(lí)心機(jī)（不要根據轉速rpm模式設置），所有離(lí)心步驟都(dōu)需要在4℃低溫離(lí)心機(jī)中進行。
2.
溶液混勻後放(fàng)置于冰上。将離(lí)心柱套入2
ml連蓋收集管中，蓋好管蓋，放(fàng)置于冰上預冷(lěng)。
3.
蛋白(bái)提取推薦添加蛋白(bái)酶抑制劑（自(zì)備，試劑盒不提供），根據蛋白(bái)酶抑制劑母液濃度提前添加在裂解緩沖液中（添加時按照(zhào)1:100添加，即1ml裂解緩沖液 添加10
μl抑制劑）。研究蛋白(bái)磷酸化，需要添加磷酸酶抑制劑（自(zì)備，試劑盒不提供）。
4.
蛋白(bái)定量推薦使用BCA方法，可(kě)以選擇BCA蛋白(bái)濃度測定試劑盒（貨号：RTP7102）。
● 使用方法：
一 培養細胞活性蛋白(bái)提取：
1.1 即用型裂解緩沖液配制：
取适當體(tǐ)積的預冷(lěng)裂解緩沖液，在使用前數分(fēn)鍾内加入1/100體(tǐ)積的蛋白(bái)酶抑制劑（100×）（自(zì)備，試劑盒不提供），如(rú)果進行蛋白(bái)磷酸化研究，需要加入1/100體(tǐ)積的磷酸酶抑制劑（100×）（自(zì)備，試劑盒不提供），随後立即放(fàng)于冰上待用（30分(fēn)鍾内使用）。
按照(zhào)下表大(dà)體(tǐ)估算裂解緩沖液使用體(tǐ)積：
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細胞類型
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培養器皿
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細胞數量
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細胞沉澱體(tǐ)積（PCV）（μl）
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裂解緩沖液（μl）
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懸浮細胞
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2-5×106
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20-50
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200
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5-10×106
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＞50
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500
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貼壁細胞
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96孔闆
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~1×105
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調整細胞數目到2-5×106
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200
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24孔闆
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~5×105
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調整細胞數目到2-5×106
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200
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6孔闆
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~2.5×106
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~25
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200
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25cm2培養瓶
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~2×106
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~20
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200
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75cm2培養瓶
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~8×106
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~80
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500
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35
mm培養皿
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~2×106
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~20
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200
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60
mm培養皿
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~5×106
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~50
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500
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100
mm培養皿
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~1.5×107
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調整細胞數目到2-5×106
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200
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注：
(二百萬，2×106)HeLa細胞，其細胞沉澱體(tǐ)積（PCV，Packed Cell Volume）大(dà)約爲20 μl。
1.2 準備細胞：
1.2.1
對于貼壁細胞：細胞用PBS漂洗一遍，棄PBS；再加入适量PBS，用細胞刮刀刮下細胞，或用0.02%
EDTA（0.5
mM）溶液處理(lǐ)細胞使細胞不再貼壁很緊，并用移液器吹打下細胞。400
g（~2000
rpm）
4℃離(lí)心5
min收集細胞，盡最大(dà)努力吸盡上清，留下細胞沉澱備用。盡量避免用胰酶消化細胞，以免胰酶降解需抽提的目的蛋白(bái)。
1.2.2
對于懸浮細胞：400
g（~2000
rpm）4℃離(lí)心5
min收集細胞，用PBS洗一遍，離(lí)心收集細胞，盡最大(dà)努力吸盡上清，留下細胞沉澱備用。
1.3 裂解細胞膜：
1.3.1細胞沉澱中加入準備好的裂解緩沖液（含蛋白(bái)酶抑制劑），用移液器吹打重懸細胞沉澱，渦旋劇(jù)烈震蕩30-60秒，冰浴處理(lǐ)10分(fēn)鍾，間歇2-3次混勻。
注：裂解緩沖液使用推薦經驗值：起始細胞數低于5×106加入
200 μl 裂解緩沖液，起始細胞數在5×106-1×107之間加入500
μl。如(rú)果細胞數目低于1×106或高于1×107，建議(yì)調整細胞數目在2-5×106範圍内。
1.3.2
将細胞懸液轉移到離(lí)心柱中，蓋上管蓋，16,000
g（~13000
rpm）
4℃離(lí)心1分(fēn)鍾，離(lí)心後可(kě)見(jiàn)收集管底部有沉澱形成。
注：離(lí)心柱最大(dà)體(tǐ)積爲600 μl；确保離(lí)心機(jī)轉速可(kě)以在1分(fēn)鍾内升速到16000 g。
1.3.3 棄去(qù)離(lí)心柱，蓋好2 ml收集管管蓋，用1ml移液器輕柔吹打重懸收集管中的沉澱。
1.4 去(qù)除細胞核和未破碎的細胞：
将懸浮溶液16000 g（~13000 rpm）
4℃離(lí)心15分(fēn)鍾。
1.5 收集上清：
收集上清即爲胞漿蛋白(bái)，其蛋白(bái)濃度約爲0.5-2 μg/μl，不同細胞略有不同。
關鍵步驟：吸取上清時不要觸及沉澱，甚至可(kě)以丢棄部分(fēn)上清不吸取，以免上清中污染其他(tā)蛋白(bái)。
二 實驗示例：
5×106 K562細胞，400g 3min收集，PBS漂洗一次；加500 μl 即用型提取緩沖液（含蛋白(bái)酶抑制劑），震蕩 60秒，冰浴10min；16000g 1min 過離(lí)心柱；重懸沉澱；4度 16000g 15 min，取上清即爲胞漿活性蛋白(bái)。BCA測定蛋白(bái)濃度，蛋白(bái)得(de)率2×108細胞提取蛋白(bái)量約1.5 mg。BN電泳（右圖）：RTD6140 配制10% BN膠。使用 4×BN蛋白(bái)上樣緩沖液（貨号：PL114）調整上樣濃度爲0.5μg/μl。1×藍色陰極電泳緩沖液 200V 50min，更換爲1×無色陰極緩沖液，電泳時間共93min，FastBlue蛋白(bái)染色液染色。變性電泳（左圖）：RealPAGE 4-18%預制膠，用RIPA提取總蛋白(bái)（RIPA-TP）做對照(zhào)樣品，使用 含BME上樣緩沖液調整上樣濃度爲0.5μg/μl，200V 60min，FastBlue蛋白(bái)染色液染色。