動物膜蛋白(bái)提取試劑盒（細胞樣品）

(Animal Membrane Protein Extraction Kit for Cells)

● 産品簡介

動物膜蛋白(bái)提取試劑盒（細胞樣品）(Animal Membrane Protein Extraction Kit for Cells)提供了一種簡便的地從(cóng)培養細胞或貼壁細胞中提取膜蛋白(bái)的方法。提取的膜蛋白(bái)不僅包括質膜上的膜蛋白(bái)，也包括細胞器膜如(rú)線粒體(tǐ)膜、内質網膜和高爾基體(tǐ)膜上的膜蛋白(bái)。

本産品與許多用于分(fēn)離(lí)膜蛋白(bái)的程序不同，該試劑盒不需要超聲，不需要耗時的超速離(lí)心，不使用去(qù)垢劑，最大(dà)限度地保持了膜蛋白(bái)在細胞内的原始狀态。提取的基本原理(lǐ)是通過提取溶液和離(lí)心柱的協調作(zuò)用提取得(de)到高純度的膜蛋白(bái)。膜蛋白(bái)提取溶液可(kě)以溫和作(zuò)用于細胞膜，改變細胞的滲透壓，然後在高速離(lí)心下細胞通過離(lí)心柱，這個過程中細胞膜會破裂；收集液700 g低速離(lí)心分(fēn)離(lí)去(qù)除細胞核，因此消除了膜組分(fēn)中細胞核組份的污染；随後上清使用常規台式低溫離(lí)心機(jī)（無需超速離(lí)心）16000 g高速離(lí)心，沉澱即爲膜蛋白(bái)。

該産品約60分(fēn)鍾即可(kě)完成培養細胞膜蛋白(bái)的提取。膜蛋白(bái)是在溫和、非變性條件(jiàn)下提取的，結合不同的溶解液，溶解後的膜蛋白(bái)可(kě)以用于SDS-PAGE變性電泳檢測、Blue Native非變性電泳檢測以及等電聚焦電泳等。另外，膜蛋白(bái)也可(kě)以用于酶活性測定，免疫沉澱，ELISA測定等。

對于細胞樣品，如(rú)果每次使用細胞的數量爲2-5×10⁶，本試劑盒可(kě)以提取125個樣品；如(rú)果每次使用的細胞數量爲1×10⁷細胞，本試劑盒可(kě)以提取50個樣品。

● 産品組成

● 貯存、效期和運輸：

根據标簽溫度貯存；一年(nián)有效；試劑盒常溫運輸。

● 用前必讀(dú)：

1. 離(lí)心機(jī)請(qǐng)調整成RCF/g模式，按照(zhào)離(lí)心力設置離(lí)心機(jī)（不要根據轉速rpm模式設置），所有離(lí)心步驟都(dōu)需要在4℃低溫離(lí)心機(jī)中進行。

2. 将膜蛋白(bái)提取溶液混勻後放(fàng)置于冰上。将離(lí)心柱套入2 ml連蓋收集管中，蓋好管蓋，放(fàng)置于冰上預冷(lěng)。

3. 蛋白(bái)提取推薦添加蛋白(bái)酶抑制劑（自(zì)備，試劑盒不提供），根據蛋白(bái)酶抑制劑母液濃度提前添加在膜蛋白(bái)提取溶液中（如(rú)抑制劑母液是 100×，添加時按照(zhào)1:100添加，即1ml膜蛋白(bái)提取溶液添加10μl抑制劑）。研究蛋白(bái)磷酸化，需要添加磷酸酶抑制劑（自(zì)備，試劑盒不提供）。

4. 蛋白(bái)定量推薦使用BCA方法，可(kě)以選擇BCA蛋白(bái)濃度測定試劑盒（貨号：RTP7102）。

● 使用方法：

一 培養細胞膜蛋白(bái)提取：

1.1 準備溶液：

混勻膜蛋白(bái)提取溶液，立即放(fàng)置在冰上。取适當量的溶液，在使用前數分(fēn)鍾内加入蛋白(bái)酶抑制劑（自(zì)備，試劑盒不提供），随後立即放(fàng)于冰上待用。按照(zhào)下表大(dà)體(tǐ)估算膜蛋白(bái)提取溶液使用體(tǐ)積：

注： (二百萬，2×10⁶)HeLa細胞，其細胞沉澱體(tǐ)積（PCM，Packed Cell Volume）大(dà)約爲20 μl。

1.2 準備細胞：

1.2.1 對于貼壁細胞：細胞用PBS漂洗一遍，棄PBS；再加入适量PBS，用細胞刮刀刮下細胞，或用0.02% EDTA（0.5 mM）溶液處理(lǐ)細胞使細胞不再貼壁很緊，并用移液器吹打下細胞。400 g（~2000 rpm） 4℃離(lí)心5 min收集細胞，盡最大(dà)努力吸盡上清，留下細胞沉澱備用。盡量避免用胰酶消化細胞，以免胰酶降解需提取的目的蛋白(bái)。

1.2.2 對于懸浮細胞：400 g（~2000 rpm）4℃離(lí)心5 min收集細胞，用PBS洗一遍，離(lí)心收集細胞，盡最大(dà)努力吸盡上清，留下細胞沉澱備用。

1.3 裂解細胞膜：

1.3.1細胞沉澱中加入準備好的膜蛋白(bái)提取溶液（含蛋白(bái)酶抑制劑），用移液器吹打重懸細胞沉澱，渦旋劇(jù)烈震蕩30-60秒，冰浴處理(lǐ)10分(fēn)鍾，間歇2-3混勻。

注：提取溶液使用推薦經驗值：起始細胞數低于5×10⁶加入 200 μl 提取溶液，起始細胞數量5×10⁶-1×10⁷加入500 μl提取溶液。如(rú)果細胞數目低于1×10⁶或高于1×10⁷，建議(yì)調整細胞數目在2-5×10⁶範圍内。

1.3.2 将細胞懸液轉移到離(lí)心柱中，蓋上管蓋，16,000 g（~13000 rpm） 4℃離(lí)心1分(fēn)鍾，離(lí)心後收集管底部會有沉澱形成。

     注：離(lí)心柱最大(dà)體(tǐ)積爲600 μl；确保離(lí)心機(jī)可(kě)以在10秒内達到16000 g。

   1.3.3 棄去(qù)離(lí)心柱，蓋好2 ml收集管管蓋，用1ml移液器輕柔吹打重懸收集管中的沉澱。

1.4 去(qù)除細胞核：

溶液700 g（~2700 rpm） 4℃離(lí)心1分(fēn)鍾，用200 μl吸頭小心将上清（上清稍有渾濁）轉移到新的1.5 ml離(lí)心管中。注意：轉速不要超過700g，否則會降低膜蛋白(bái)的得(de)率。

     關鍵步驟：吸取上清時不要觸及沉澱，甚至可(kě)以丢棄部分(fēn)上清不吸取，以免上清（含膜蛋白(bái)）中污染核蛋白(bái)。如(rú)果使用200 μl提取溶液，建議(yì)吸取150 μl上清；使用500 μl提取溶液，建議(yì)吸取400 μl上清。此步驟得(de)到的細胞核純度不高，混雜有沒有完全破碎的完整細胞，不建議(yì)用于相(xiàng)關實驗。

1.5 沉澱膜蛋白(bái)：

上清溶液16000 g（~13000 rpm） 4℃離(lí)心30分(fēn)鍾，用200 μl吸頭吸棄上清，沉澱即爲提取的膜蛋白(bái)。上清是胞漿蛋白(bái)，如(rú)需要可(kě)保存備用。

關鍵步驟：此步驟必須完全将上清吸取幹淨，可(kě)以分(fēn)次吸取上清，最後用10 μl吸頭将殘餘上清徹底吸淨，以免膜蛋白(bái)中污染胞漿蛋白(bái)。

 二 膜蛋白(bái)溶解：

膜蛋白(bái)沉澱可(kě)以根據下遊實驗需求用50 μl相(xiàng)應溶解液溶解。

注：不建議(yì)加入超過50 μl溶解液，會導緻蛋白(bái)濃度偏低。

2.1 膜蛋白(bái)變性樣品處理(lǐ)：

2.1.1 建議(yì)使用50 μl變性蛋白(bái)溶解液（貨号：PS1020）溶解膜蛋白(bái)；

2.1.2 BCA方法測定蛋白(bái)濃度；

2.1.3用變性蛋白(bái)溶解液調整蛋白(bái)濃度爲1 μg/μl，按需分(fēn)裝，每管50 μl，-80℃保存待用；

2.1.4取一管50 μl樣品加入SDS-PAGE上樣緩沖液（貨号：PL080，PL113，PL121）處理(lǐ)，建議(yì)調整上樣液濃度爲0.5 μg/μl；對于多次跨膜蛋白(bái)（Multi-pass membrane protein）的變性電泳檢測，樣品建議(yì)使用37℃處理(lǐ)30分(fēn)鍾或者70度處理(lǐ)10分(fēn)鍾，不要95℃加熱(rè)5分(fēn)鍾，因爲在95℃高溫情況下，多次跨膜蛋白(bái)極易聚集形成多聚體(tǐ)，樣品會聚集，WB檢測會表現爲比實際蛋白(bái)大(dà)小更大(dà)的分(fēn)子量；

2.1.5 使用SDS-PAGE凝膠（貨号：RTD6132，RTD6116）電泳，每個泳道上樣10-40 μl（5-20 μg）。

2.2 膜蛋白(bái)BN非變性樣品處理(lǐ)：

2.2.1 建議(yì)使用50 μl膜蛋白(bái)重懸液（BN電泳用）（貨号：PN1020）重懸膜蛋白(bái)沉澱；

2.2.2 BCA方法測定蛋白(bái)濃度（貨号：RTP7102）；

2.2.3 用膜蛋白(bái)重懸液（BN電泳用）調整蛋白(bái)濃度爲1 μg/μl，按需分(fēn)裝，每管50 μl，-80℃保存待用；

2.2.4 取一管50 μl樣品，溶化混勻後4℃ 16000 g 5分(fēn)鍾，去(qù)除上清，保留沉澱；

2.2.5 沉澱中加入50 μl膜蛋白(bái)增溶液A（貨号：DM1080），輕柔重懸沉澱，盡量不産生(shēng)氣泡，冰浴10分(fēn)鍾；

膜蛋白(bái)增溶液A配制方法：在增溶劑粉末管中加入2.5 ml溶解緩沖液，加入超純水精準定容至5 ml，徹底混勻，增溶液中DDM終濃度爲1%。

2.2.6 4℃ 16000 g 15分(fēn)鍾，取上清至一幹淨1.5 ml離(lí)心管中即爲增溶後膜蛋白(bái)溶液（小心不要吸取沉澱），此時得(de)到的膜蛋白(bái)濃度爲1 μg/μl，其中去(qù)垢劑DDM（n-Dodecyl β-D-maltoside，β-DM n-十二烷基-β-D-麥芽糖苷）終濃度爲1%；

2.2.7 膜蛋白(bái)溶液中加入1/10體(tǐ)積10×膜蛋白(bái)A型上樣緩沖液（配套膜蛋白(bái)增溶液A使用）（貨号：PL130），使用BN凝膠電泳（貨号：RTD6139，RTD6140），每個泳道上樣5-20 μg。

2.3 膜蛋白(bái)等電聚焦樣品處理(lǐ)（2D凝膠第一維電泳）：

建議(yì)膜蛋白(bái)沉澱中使用溶解液：7 M尿素,2 M硫脲, 2%CHAPS,20mM DTT(自(zì)備，試劑盒不提供)。

 三 關于膜蛋白(bái)産量和質量的評價：

 3.1 膜蛋白(bái)産量：

3.2 膜蛋白(bái)質量評價：

膜蛋白(bái)質量評價首先看(kàn)提取的蛋白(bái)是否是膜蛋白(bái)，其次要看(kàn)膜蛋白(bái)是否有明顯的富集，其三要看(kàn)提出的膜蛋白(bái)是否有其他(tā)組分(fēn)交叉污染，最後看(kàn)提取的膜蛋白(bái)中是否可(kě)以檢測出目的蛋白(bái)。使用專門(mén)的膜内參檢測（下表），可(kě)以初步确認提出的是膜蛋白(bái)。膜蛋白(bái)是否有效富集需要用總蛋白(bái)作(zuò)爲對照(zhào)，與總蛋白(bái)相(xiàng)比，膜蛋白(bái)中膜蛋白(bái)内參是否有明顯富集。膜蛋白(bái)中的交叉污染可(kě)以用其他(tā)組分(fēn)内參檢測膜蛋白(bái)樣品，如(rú)關注膜蛋白(bái)中是否有細胞核蛋白(bái)污染，可(kě)以使用核蛋白(bái)内參如(rú)Lamin B1檢測膜蛋白(bái)，檢測無條帶即說(shuō)明膜蛋白(bái)與細胞核組分(fēn)無交叉污染。用目标蛋白(bái)抗體(tǐ)檢測膜蛋白(bái)，驗證是否可(kě)以檢測到目的蛋白(bái)，蛋白(bái)大(dà)小是否符合預期。

許多研究人(rén)員(yuán)利用 WB對分(fēn)離(lí)的膜蛋白(bái)進行純度檢測，經常發現一些常用的胞漿内參能在膜蛋白(bái)中檢測到，例如(rú)β-actin^[1], GAPDH ^[2] 和  β-tubulin ^[3]，這是由于這些胞漿内參不僅存在于胞漿也存在于質膜中，因此可(kě)以在膜蛋白(bái)中檢測到胞漿内參。更多信息，請(qǐng)參閱以下論文：

1. Gruenstein E., et al. (1975). Actin associated with membranes from 3T3 mouse fibroblast and Hela cells. Journal of cell Biology. 64:223-234.  

2. Terrasse R., et al. (2012). Human and pneumococcal cell surface glyceraldehydes  -3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) proteins are both ligands of human C1q protein. J. Biol. Chem. 287:42620-42633.

3. Wolff J. (2009). Plasma membrane tubulin. Biochemica et BiophysicaActa. (BBA)-Biomembranes 1788:1415-1433.

四 實驗示例：

樣品：K562細胞，膜蛋白(bái)提取試劑盒提取膜蛋白(bái)（M）和胞漿蛋白(bái)（C），RIPA提取總蛋白(bái)（TP）

溫度處理(lǐ)：樣品與SDS-PAGE蛋白(bái)上樣緩沖液（貨号：PL080）混合，37度處理(lǐ)30min，70度處理(lǐ)10min，95度處理(lǐ)5min

電泳：4-18% RealPAGE預制膠（貨号：RTD6119-0420），蛋白(bái)上樣量均爲5 μg，恒壓200V  55min

轉膜：0.45μm PVDF膜，1×RealBlot轉膜緩沖液（貨号：RT5020）濕轉，恒流400 mA 35min。

封閉：快(kuài)速封閉液（貨号：WR5020）  RT  10 min

剝離(lí)：Western一抗二抗去(qù)除液（弱堿，溫和型） （貨号：WS1200），37度搖床15 min

一抗：1 Na-K ATPase  1:5000；2 Calnexin 1:500；3 β-Tubulin 1:5000 ；4 β-Actin 1:10000；5 GAPDH 1:10000； 6 H3 1:10000；7 COXIV 1:5000；常溫搖床孵育60min

二抗：羊抗兔IgG-HRP 1:5000（貨号：HGR1020），羊抗鼠IgG-HRP 1:5000（貨号：HGM1060），常溫搖床孵育60min

檢測：ECL發光(guāng)檢測（貨号：EC2520）