動物線粒體(tǐ)提取試劑盒（細胞樣品）

          (Animal Cell Mitochondria Isolation Kit)     

● 産品簡介

動物細胞線粒體(tǐ)提取試劑盒(Animal Cell Mitochondria Isolation Kit)可(kě)以快(kuài)速便捷分(fēn)離(lí)培養細胞的線粒體(tǐ)。試劑盒的緩沖系統不含任何表面活性劑和螯合劑EDTA，分(fēn)離(lí)獲得(de)的線粒體(tǐ)純度較高，并且絕大(dà)部分(fēn)分(fēn)離(lí)獲得(de)的線粒體(tǐ)都(dōu)含有完整的内膜和外膜，可(kě)以用于線粒體(tǐ)的生(shēng)理(lǐ)功能等方面的研究。另外，優化的裂解配方配套離(lí)心柱法有效裂解細胞，省去(qù)了經典方法使用玻璃勻漿器的繁瑣操作(zuò)，更加省時省力。同時，本試劑盒在分(fēn)離(lí)線粒體(tǐ)的同時可(kě)以獲得(de)去(qù)除線粒體(tǐ)的細胞胞漿蛋白(bái)，可(kě)以研究線粒體(tǐ)蛋白(bái)向胞漿内的運輸機(jī)制。

該産品約30分(fēn)鍾即可(kě)完成培養細胞線粒體(tǐ)的提取。線粒體(tǐ)是在溫和、非變性條件(jiàn)下提取的，結合不同的溶解液，溶解後的線粒體(tǐ)可(kě)以用于SDS-PAGE變性電泳檢測、Blue Native非變性電泳檢測以及等電聚焦電泳等。另外，提取的線粒體(tǐ)具有生(shēng)理(lǐ)功能，可(kě)以用于線粒體(tǐ)的生(shēng)理(lǐ)功能等方面的研究。

按照(zhào)每次提取2×10⁷細胞計(jì)算，試劑盒可(kě)以使用大(dà)約50次。

● 産品組成

● 貯存條件(jiàn)和運輸：

按照(zhào)标簽溫度貯存；有效期一年(nián)；濕冰運輸。

● 用前必讀(dú)：

1. 離(lí)心機(jī)請(qǐng)調整成RCF/g模式，按照(zhào)離(lí)心力設置離(lí)心機(jī)（不要根據轉速rpm模式設置），所有離(lí)心步驟都(dōu)需要在4℃低溫離(lí)心機(jī)中進行。

2. 将分(fēn)離(lí)緩沖液A，分(fēn)離(lí)緩沖液B，漂洗緩沖液和貯存緩沖液混勻後放(fàng)置于冰上。将離(lí)心柱套入2 ml連蓋收集管中，蓋好管蓋，放(fàng)置于冰上預冷(lěng)。

3. 蛋白(bái)提取推薦添加蛋白(bái)酶抑制劑（自(zì)備，試劑盒不提供），根據蛋白(bái)酶抑制劑母液濃度提前添加在膜蛋白(bái)提取溶液中（如(rú)抑制劑母液是 100×，添加時按照(zhào)1:100添加，即1ml膜蛋白(bái)提取溶液添加10μl抑制劑）。研究蛋白(bái)磷酸化，需要添加磷酸酶抑制劑（自(zì)備，試劑盒不提供）。

4. 蛋白(bái)定量推薦使用BCA方法，可(kě)以選擇BCA蛋白(bái)濃度測定試劑盒（貨号：RTP7102）。

● 使用方法：

一. 準備溶液：

常溫溶解試劑盒中的各種溶液，溶解後立即置于冰上并混勻。如(rú)果最終實驗目的是制備線粒體(tǐ)蛋白(bái)樣品，根據樣品數量，取适量體(tǐ)積分(fēn)離(lí)緩沖液A加入蛋白(bái)酶抑制劑。按照(zhào)下表大(dà)體(tǐ)估算分(fēn)離(lí)緩沖液A的使用體(tǐ)積：

注:(二百萬，2×10⁶)HeLa細胞，其細胞沉澱體(tǐ)積（PCV，Packed Cell Volume）大(dà)約爲20 μl。

二. 收集細胞：

2.1 對于貼壁細胞：細胞用PBS漂洗一遍，棄PBS；再加入适量PBS，用細胞刮刀刮下細胞，或用0.02% EDTA（0.5 mM）溶液處理(lǐ)細胞使細胞不再貼壁很緊，并用移液器吹打下細胞。400 g（~2000 rpm） 4℃離(lí)心5 min收集細胞，盡最大(dà)努力吸盡上清，留下細胞沉澱備用。盡量避免用胰酶消化細胞，以免胰酶降解需提取的目的蛋白(bái)。

2.2 對于懸浮細胞：400 g（~2000 rpm）4℃離(lí)心5 min收集細胞，用PBS洗一遍，離(lí)心收集細胞，盡最大(dà)努力吸盡上清，留下細胞沉澱備用。

三. 裂解細胞膜：

3.1細胞沉澱中加入250 μl準備好的分(fēn)離(lí)緩沖液A（含蛋白(bái)酶抑制劑），用移液器吹打重懸細胞沉澱，渦旋劇(jù)烈震蕩30-60秒，冰浴處理(lǐ)10分(fēn)鍾，間歇2-3混勻。

注：建議(yì)将起始細胞數不要低于2×10⁷，否則将導緻最後線粒體(tǐ)得(de)率過低。

3.2 将細胞懸液轉移到離(lí)心柱中，蓋上管蓋，16,000 g（~13000 rpm） 4℃離(lí)心1分(fēn)鍾，離(lí)心後收集管底部會有沉澱形成。

     注：離(lí)心柱最大(dà)體(tǐ)積爲600 μl；确保離(lí)心機(jī)可(kě)以在10秒内達到16000 g。

3.3 棄去(qù)離(lí)心柱，蓋好2 ml收集管管蓋，用1ml移液器輕柔吹打重懸收集管中的沉澱。

四. 去(qù)除細胞核和未破碎的細胞：

溶液700 g（~2700 rpm） 4℃離(lí)心1分(fēn)鍾，用200 μl吸頭小心将上清（上清稍有渾濁）轉移到新的1.5 ml離(lí)心管中。注意：轉速不要超過700g，否則會降低線粒體(tǐ)的得(de)率。

關鍵步驟：吸取上清時不要觸及沉澱，甚至可(kě)以丢棄部分(fēn)上清不吸取，以免上清（含線粒體(tǐ)）中污染核蛋白(bái)。如(rú)果使用250 μl分(fēn)離(lí)緩沖液A，建議(yì)吸取200 μl上清。此步驟得(de)到的細胞核純度不高，混雜有沒有完全破碎的完整細胞，不建議(yì)用于相(xiàng)關實驗。

五. 收集線粒體(tǐ)：

5.1 上清中加入等體(tǐ)積的分(fēn)離(lí)緩沖液B（如(rú)步驟4吸取200 μl上清，則加入200 μl分(fēn)離(lí)緩沖液B），混勻；

5.2 16000 g（~13000 rpm） 4℃離(lí)心10分(fēn)鍾，用200 μl吸頭吸去(qù)上清，沉澱即爲提取的線粒體(tǐ)。上清是胞漿蛋白(bái)，如(rú)需要可(kě)保存備用。

關鍵步驟：此步驟必須完全将上清吸取幹淨，可(kě)以用200μl吸頭分(fēn)次吸取上清，最後用10 μl吸頭将殘餘上清徹底吸淨，以免線粒體(tǐ)中污染胞漿蛋白(bái)。

六. 線粒體(tǐ)漂洗：

   線粒體(tǐ)沉澱中加入0.5 ml 漂洗緩沖液，輕柔重懸沉澱，16,000 g，4℃離(lí)心5分(fēn)鍾，棄上清，沉澱即爲漂洗後的線粒體(tǐ)。

七. 線粒體(tǐ)的使用：

7.1 線粒體(tǐ)功能研究：

如(rú)果用于完整線粒體(tǐ)的功能或酶活性研究，初始2×10⁷細胞分(fēn)離(lí)得(de)到的線粒體(tǐ)樣品中加入100-150 μl線粒體(tǐ)貯存緩沖液，重懸線粒體(tǐ)後-80℃備用。不建議(yì)長期貯存，盡快(kuài)使用。

7.2 線粒體(tǐ)蛋白(bái)電泳：

7.2.1線粒體(tǐ)蛋白(bái)變性樣品處理(lǐ)：

7.2.1.1 初始2×10⁷細胞分(fēn)離(lí)得(de)到的線粒體(tǐ)沉澱中建議(yì)使用50 μl變性蛋白(bái)溶解液（貨号：PS1020）溶解線粒體(tǐ)沉澱；

7.2.1.2 BCA方法測定蛋白(bái)濃度（貨号：RTP7102）；

7.2.1.3用變性蛋白(bái)溶解液調整蛋白(bái)濃度爲1 μg/μl，按需分(fēn)裝，每管50 μl，-80℃保存待用；

7.2.1.4取一管50 μl樣品加入SDS-PAGE上樣緩沖液（貨号：PL080，PL113，PL121）處理(lǐ)，建議(yì)調整上樣液濃度爲0.5 μg/μl；對于多次跨膜蛋白(bái)（Multi-pass membrane protein）的變性電泳檢測，樣品建議(yì)使用37℃處理(lǐ)30分(fēn)鍾，不要95℃加熱(rè)5分(fēn)鍾，因爲在95℃高溫情況下，多次跨膜蛋白(bái)極易聚集形成多聚體(tǐ)，樣品會聚集，WB檢測會表現爲比實際蛋白(bái)大(dà)小更大(dà)的分(fēn)子量；

7.2.1.5 使用SDS-PAGE凝膠（貨号：RTD6132，RTD6116）電泳，每個泳道上樣10-40 μl（5-20 μg）。

7.2.2 線粒體(tǐ)蛋白(bái)BN非變性樣品處理(lǐ)：

7.2.2.1 初始2×10⁷細胞分(fēn)離(lí)得(de)到的線粒體(tǐ)沉澱中建議(yì)使用50 μl膜蛋白(bái)重懸液（BN電泳用）（貨号:PN1020）重懸線粒體(tǐ)沉澱；

7.2.2.2 BCA方法測定蛋白(bái)濃度（貨号：RTP7102）；

7.2.2.3 用膜蛋白(bái)重懸液（BN電泳用）（貨号：PN1020）調整蛋白(bái)濃度爲1 μg/μl，按需分(fēn)裝，每管50 μl，-80℃保存待用；

7.2.2.4 取一管50 μl樣品，溶化混勻後4℃ 16000 g 5分(fēn)鍾，去(qù)除上清，保留沉澱；

7.2.2.5 沉澱中加入50 μl膜蛋白(bái)增溶液A（貨号：DM1080），輕柔重懸沉澱，盡量不産生(shēng)氣泡，冰浴10分(fēn)鍾；

7.2.2.6 4℃ 16000 g 15分(fēn)鍾，取上清至一幹淨1.5 ml離(lí)心管中即爲增溶後線粒體(tǐ)蛋白(bái)溶液（小心不要吸取沉澱），此時得(de)到的線粒體(tǐ)蛋白(bái)濃度爲1 μg/μl，其中去(qù)垢劑DDM（n-Dodecyl β-D-maltoside，β-DM， n-十二烷基-β-D-麥芽糖苷）終濃度爲1%；

7.2.2.7 線粒體(tǐ)蛋白(bái)溶液中加入1/10體(tǐ)積10×膜蛋白(bái)A型上樣緩沖液（配套膜蛋白(bái)增溶液A使用）（貨号：PL130），使用BN凝膠電泳（貨号：RTD6139，RTD6140），每個泳道上樣5-20 μg。

7.2.3 線粒體(tǐ)蛋白(bái)等電聚焦樣品處理(lǐ)（2D凝膠第一維電泳）：

建議(yì)線粒體(tǐ)沉澱中使用溶解液：7 M尿素,2 M硫脲, 2%CHAPS,20 mM DTT(自(zì)備，試劑盒不提供)。

八 線粒體(tǐ)産量和質量的評價：

8.1 線粒體(tǐ)産量：

8.2 線粒體(tǐ)質量評價：

線粒體(tǐ)質量評價首先看(kàn)提取的線粒體(tǐ)是否具有完整的内外膜結構（進行線粒體(tǐ)功能活性研究），其次要看(kàn)裂解後的線粒體(tǐ)蛋白(bái)是否有明顯的富集，其三要看(kàn)裂解後的線粒體(tǐ)蛋白(bái)是否有其他(tā)組分(fēn)交叉污染，最後看(kàn)提取的線粒體(tǐ)中是否可(kě)以檢測出目的蛋白(bái)。使用專門(mén)的線粒體(tǐ)内參檢測（下表），可(kě)以初步确認提出的是線粒體(tǐ)蛋白(bái)。線粒體(tǐ)蛋白(bái)是否有效富集需要用總蛋白(bái)作(zuò)爲對照(zhào)，與總蛋白(bái)相(xiàng)比，線粒體(tǐ)内參蛋白(bái)是否有明顯富集。線粒體(tǐ)蛋白(bái)中的交叉污染可(kě)以用其他(tā)組分(fēn)内參檢測線粒體(tǐ)蛋白(bái)樣品，如(rú)關注線粒體(tǐ)蛋白(bái)中是否有胞漿蛋白(bái)污染，可(kě)以使用胞漿蛋白(bái)内參檢測線粒體(tǐ)蛋白(bái)，檢測條帶的強弱即說(shuō)明線粒體(tǐ)蛋白(bái)與胞漿蛋白(bái)交叉污染的程度。用目标蛋白(bái)抗體(tǐ)檢測線粒體(tǐ)蛋白(bái)，驗證是否可(kě)以檢測到目的蛋白(bái)，蛋白(bái)大(dà)小是否符合預期。

許多研究人(rén)員(yuán)利用 WB對分(fēn)離(lí)的線粒體(tǐ)蛋白(bái)進行純度檢測，經常發現一些常用的胞漿内參能在線粒體(tǐ)蛋白(bái)中檢測到，例如(rú)β-actin^[1], GAPDH ^[2] 和 β-tubulin，這是由于這些胞漿内參不僅存在于胞漿也存在于線粒體(tǐ)中，因此可(kě)以在線粒體(tǐ)蛋白(bái)中檢測到胞漿内參。更多信息，請(qǐng)參閱以下論文：

1 Hatch, Anna L., Pinar S. Gurel, and Henry N. Higgs. Novel roles for actin in mitochondrial fission. Journal of Cell Science (2014) 127, 1–12

2 Zhang, Jin-Ying, et al. Critical protein GAPDH and its regulatory mechanisms in cancer cells. Cancer Biol Med 2015;12:10-22.

九 實驗示例：