His标簽蛋白(bái)純化試劑盒
産品編号
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産品名稱
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包裝
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RTD8201
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His标簽蛋白(bái)純化試劑盒
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20次
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● 産品簡介:
His标簽蛋白(bái)純化試劑盒(His-tag Protein Purification Kit)也稱爲鎳柱試劑盒,采用NTA
His-tag 純化樹(shù)脂可(kě)以兼容高濃度變性劑(8M尿素或6M鹽酸胍),能夠簡單、快(kuài)速、靈活、高效并且高特異性地在非變性或變性條件(jiàn)下純化His标簽蛋白(bái)。純化原理(lǐ):通常帶有6個組氨酸标簽的重組蛋白(bái)(6X His-tagged recombinant protein)或帶有6個以上連續組氨酸标簽的重組蛋白(bái),被稱爲His标簽蛋白(bái)。蛋白(bái)樣品溶液通過NTA His-tag 純化樹(shù)脂時,重組蛋白(bái)His标簽上的組氨酸殘基能特異性地結合到樹(shù)脂中的鎳離(lí)子上,其它蛋白(bái)則不能被結合。洗滌後,His标簽重組蛋白(bái)被洗脫,從(cóng)而被分(fēn)離(lí)純化。
試劑盒配套的NTA His-tag 純化樹(shù)脂采用高度交聯的6%瓊脂糖凝膠(Sepharose
CL-6B)爲基質,并使用了進一步優化的連接臂和鎳離(lí)子螯合技術(shù),非特異性蛋白(bái)結合顯著降低,耐受壓力強,鎳離(lí)子螯合非常穩定。具體(tǐ)參數如(rú)下:
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NTA
His-tag 純化樹(shù)脂參數
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顆粒直徑
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45-165 μm
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最大(dà)蛋白(bái)結合量
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25-35 mg/ml樹(shù)脂
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pH穩定性
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3-12長期
2-14短(duǎn)期
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貯存溶液
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20%乙醇
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耐受壓力
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推薦流速
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0.5 ml/min
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本試劑盒用途廣泛,可(kě)以用于在非變性條件(jiàn)和變性條件(jiàn)下純化His标簽蛋白(bái)。試劑盒配套有蛋白(bái)純化柱,隻需通過離(lí)心即可(kě)完成His标簽蛋白(bái)的結合、漂洗及洗脫步驟,方便快(kuài)捷。
按照(zhào)每次收集2 ml細菌沉澱,每次使用50 μl NTA His-tag樹(shù)脂純化,參考本說(shuō)明書(shū)本試劑盒足夠進行20次的小量His 标簽蛋白(bái)純化。每次蛋白(bái)(~55kD)的最大(dà)純化量爲0.5-1 mg。
● 貯存及運輸:
4-8℃保存,至少一年(nián)有效;試劑盒常溫運輸。
● 産品組成:
産品貨号
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産品名稱
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包裝
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貯存
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RTD8201-01
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NTA His-tag純化樹(shù)脂
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1 ml
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4-8℃
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RTD8201-02
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非變性裂解液
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25 ml
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4-8℃
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RTD8201-03
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非變性漂洗液
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25 ml
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4-8℃
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RTD8201-04
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非變性洗脫液
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2 ml
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4-8℃
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RTD8201-05
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溶菌酶 100mg/ml
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0.5 ml
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4-8℃
(配制後-20℃)
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RTD8201-06
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變性裂解液
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25 ml
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4-8℃
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RTD8201-07
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變性漂洗液
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25 ml
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4-8℃
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RTD8201-08
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變性洗脫液
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2 ml
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4-8℃
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HP-50
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蛋白(bái)純化柱(含篩闆和堵頭)
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20套
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RT
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-
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2 ml收集管
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20個
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RT
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說(shuō)明書(shū)
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-
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-
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● 使用說(shuō)明:
一. 大(dà)腸杆菌中His标簽重組蛋白(bái)的誘導表達:
1.1 挑取含His标簽重組蛋白(bái)的單克隆,接種到10 ml相(xiàng)應抗生(shēng)素的LB培養液中,培養過夜。
1.2 按照(zhào)1:20的比例取培養過夜的菌液,接種到含相(xiàng)應抗生(shēng)素的LB培養液中。例如(rú)取1ml培養過夜的菌液接種到20ml含适當抗生(shēng)素的LB培養液中。
1.3 37℃常規培養約30-60 min或更長時間,至菌液的OD600達到0.6。
注:OD值非常重要,0.6爲細菌生(shēng)長的對數期。
1.4 加入IPTG至終濃度爲0.4-1 mM,适當溫度繼續培養4-5小時。
注:加入IPTG前留取1 ml菌液作(zuò)爲未誘導的對照(zhào)。對于特定蛋白(bái)的誘導表達,最佳的IPTG濃度、誘導溫度、和誘導時間需要通過實驗确定。
1.5 取2 ml菌液加入到2 ml離(lí)心管中,4℃ 13,000 g離(lí)心1min,棄上清,收集菌液沉澱。随後即可(kě)進入細菌裂解步驟。
注:菌液沉澱也可(kě)以在-80oC凍存備用。冷(lěng)凍保存的菌體(tǐ)使用前需置于冰上解凍15 min。
二. His标簽蛋白(bái)的小量純化:
2.1 裂解:
接步驟1.5,細菌沉澱中加入100 μl 非變性裂解液/變性裂解液,将細菌沉澱充分(fēn)重懸于裂解液中,可(kě)進行輕微的漩渦混勻(盡量避免産生(shēng)氣泡)。
a 裂解液的使用量:
根據His标簽重組蛋白(bái)表達的豐度,菌液和裂解液的體(tǐ)積比可(kě)以在25:1-5:1範圍内适當調整。表達豐度非常高時,每毫升菌液沉澱可(kě)以加入200 μl裂解液;表達豐度非常低時,每毫升菌液沉澱可(kě)以加入40 μl裂解液。
b 非變性裂解液和變性裂解液的選擇:
多數情況下應優先選擇非變性條件(jiàn)進行目的蛋白(bái)的裂解,因爲此條件(jiàn)下得(de)到的純化蛋白(bái)是有活性的。如(rú)果發現非變性條件(jiàn)目的蛋白(bái)的裂解效果欠佳,但(dàn)目的蛋白(bái)的表達量能達到預期時,首先宜考慮調整目的蛋白(bái)的誘導表達條件(jiàn),例如(rú)調整IPTG等誘導劑的濃度和誘導時的溫度等。如(rú)果調整誘導條件(jiàn)後在非變性條件(jiàn)下仍然裂解效果欠佳,此時再考慮選擇變性條件(jiàn)進行裂解、洗滌和洗脫。變性條件(jiàn)下使用尿素作(zuò)爲變性劑,樣品溶解性好,洗脫樣品無需透析可(kě)以直接PAGE檢測,最終純化獲得(de)的目的蛋白(bái)可(kě)以通過透析去(qù)除尿素後複性得(de)到有活性的蛋白(bái)。
2.2 可(kě)選步驟:
加入終濃度1 mM
PMSF或蛋白(bái)酶抑制劑混合物,混勻。
注:蛋白(bái)酶抑制劑能防止蛋白(bái)降解。
2.3 酶解:
加入終濃度1 mg/ml溶菌酶并輕輕混勻,盡量避免産生(shēng)氣泡,冰水浴或冰上放(fàng)置30min。
注:溶菌酶根據标簽指示用滅菌水配制成100 mg/ml的母液,現用現加。溶菌酶配制成母液後,可(kě)以适當分(fēn)裝後-20℃保存。
2.4超聲:
冰上超聲裂解細菌。超聲功率200-300
W,每次超聲處理(lǐ)10 s,每次間隔10 s,共超聲處理(lǐ)6-10次。具體(tǐ)超聲處理(lǐ)的方式須根據特定型号的超聲儀器自(zì)行摸索和優化。
注:此步驟非常重要,如(rú)果超聲不徹底,His标簽蛋白(bái)不能有效釋放(fàng),會導緻大(dà)量目的蛋白(bái)在步驟2.5離(lí)心後會留在沉澱中,導緻蛋白(bái)純化效率大(dà)大(dà)降低。
2.5 離(lí)心得(de)到上清:
4℃ 13000 rpm 離(lí)心10 min,收集上清至1.5ml離(lí)心管中,取10
μl上清留樣作(zuò)後續檢測用。待純化的His标簽蛋白(bái)即在上清中。
2.6 蛋白(bái)純化柱裝配:
2.6.1 蛋白(bái)純化空柱(純化空柱放(fàng)入2 ml收集管中)中加入50 μl NTA His-tag樹(shù)脂,旋緊蓋子,擰掉柱子底部的連接。4℃ 2000 rpm 1分(fēn)鍾,棄收集管内溶液。
注:轉速不要高于2000 rm,高轉速容易損傷樹(shù)脂。
2.6.2 純化柱中加入500 μl非變性裂解液/變性裂解液,旋緊蓋子,4℃
2000 rpm 1分(fēn)鍾,棄收集管内溶液;
2.6.3 重複2.6.2步驟一次。
注:此兩個步驟是用緩沖液平衡樹(shù)脂,可(kě)以有效提高蛋白(bái)純化效率。
2.7 樹(shù)脂螯合His标簽蛋白(bái):
2.7.1将紅(hóng)色堵頭安裝在純化柱下端突起上,純化柱中加入步驟2.5得(de)到的上清(約80-90
μl),旋緊蓋子。4℃
搖床搖動30分(fēn)鍾,使蛋白(bái)和樹(shù)脂充分(fēn)結合。
注:樹(shù)脂和蛋白(bái)結合可(kě)以混合更長時間,可(kě)以過夜處理(lǐ)。
2.7.2 拔掉紅(hóng)色堵頭,将純化柱放(fàng)入2
ml收集管中,旋緊蓋子,4℃
2000 rpm 1分(fēn)鍾。
注:建議(yì)保留流穿液待檢,檢測樹(shù)脂的結合能力。
2.8 漂洗:
2.8.1 純化柱内加入500 μl 非變性漂洗液/變性漂洗液,4℃
2000 rpm 1分(fēn)鍾,棄收集管内溶液。
2.8.2 重複2.8.1步驟再次漂洗一次。
2.9 洗脫:
2.9.1 将純化柱轉移到一幹淨1.5 ml離(lí)心管中,加入30-50
μl非變性洗脫液,輕彈混勻,4℃
2000 rpm 1分(fēn)鍾,1.5ml離(lí)心管内即爲純化的目的蛋白(bái);
2.9.2重複2.9.1再次洗脫一次。
2.10 收集:
收集兩次洗脫液即爲純化的目的蛋白(bái),-20℃或-80℃貯存。
● 實驗示例:
非變性條件(jiàn)下His-tag蛋白(bái)純化
電泳條件(jiàn):1×TGS,4-20% RealPAGE Precast Gel 150V 60min
M1:RTD6105 雙色預染寬分(fēn)子量蛋白(bái)Marker(10-170 kD)
M2:RTD6111 寬分(fēn)子量蛋白(bái)Marker(10-200 kD)
未誘導對照(zhào)(步驟1.4);IPTG誘導對照(zhào)(步驟1.6 );
離(lí)心後上清(步驟3.5 );流穿液FT(步驟3.7.2);
漂洗液1 (W1)(步驟3.8.1 );漂洗液2 (W2)(步驟3.8.2 );
洗脫液1(E1)(步驟3.9.1); 洗脫液2(E2)(步驟3.9.2)