動物核蛋白(bái)與胞漿蛋白(bái)提取試劑盒（細胞樣品）

Animal Nuclear and Cytoplasmic Protein Extraction Kit for Cells

産品貨号	名稱	規格
RTD8301	動物核蛋白(bái)與胞漿蛋白(bái)提取試劑盒（細胞樣品）	50 次

 

 

 

● 産品簡介：

在研究細胞時經常要研究細胞的不同組份，而研究得(de)最多的兩個細胞組份就(jiù)是細胞核和細胞漿。分(fēn)離(lí)核蛋白(bái)和胞漿蛋白(bái)，不僅可(kě)以用于研究蛋白(bái)在細胞内的定位，而且可(kě)以用于轉錄調控方面的研究，例如(rú)EMSA(也稱gel shift)，footprinting等。動物核蛋白(bái)與胞漿蛋白(bái)提取試劑盒(Animal Nuclear and Cytoplasmic Protein Extraction Kit)提供了一種比較簡單方便地從(cóng)培養細胞中抽提細胞核蛋白(bái)與胞漿蛋白(bái)的方法。約90分(fēn)鍾就(jiù)可(kě)以完成培養細胞的細胞核蛋白(bái)與細胞漿蛋白(bái)的分(fēn)離(lí)。抽提得(de)到的蛋白(bái)可(kě)以用于Western，EMSA，footprinting，報告基因檢測以及酶活力測定等實驗。

本試劑盒是通過細胞核提取緩沖液在低滲透壓條件(jiàn)下，使細胞充分(fēn)膨脹，破壞細胞膜，釋放(fàng)出細胞漿蛋白(bái)，然後通過離(lí)心得(de)到完整的細胞核（細胞核可(kě)以重懸于細胞核貯存緩沖液中 -80℃貯存）；細胞核用核蛋白(bái)提取試劑I裂解，配合核酸酶Benzonase消化掉核酸，離(lí)心得(de)到變性核蛋白(bái)；或者使用核蛋白(bái)提取試劑II裂解，離(lí)心得(de)到非變性（活性）核蛋白(bái)。一般情況下，胞漿蛋白(bái)與核蛋白(bái)之間的交叉污染低于10%。

對于細胞樣品，如(rú)果每個樣品的數量5×10⁶-1×10⁷，本試劑盒可(kě)以抽提50個樣品。

● 産品組成：

● 貯存條件(jiàn)和運輸：

根據标簽溫度貯存；有效期一年(nián)；試劑盒濕冰運輸。

● 用前必讀(dú)：

1. 離(lí)心機(jī)請(qǐng)調整成RCF/g模式，按照(zhào)離(lí)心力設置離(lí)心機(jī)（不要根據轉速rpm模式設置），所有離(lí)心步驟都(dōu)需要在4℃低溫離(lí)心機(jī)中進行。

2. 蛋白(bái)提取推薦添加蛋白(bái)酶抑制劑，根據蛋白(bái)酶抑制劑母液濃度提前添加在蛋白(bái)提取溶液中（如(rú)抑制劑母液是 100×，添加時按照(zhào)1:100添加）。研究蛋白(bái)磷酸化，需要添加磷酸酶抑制劑（自(zì)備，試劑盒不提供）。

3. 蛋白(bái)定量推薦使用BCA方法，可(kě)以選擇BCA蛋白(bái)濃度測定試劑盒（貨号：RTP7102）。

●  使用方法：

一 胞漿蛋白(bái)和核蛋白(bái)的提取：

1. 1準備溶液：常溫溶解試劑盒中的試劑，溶解後立即放(fàng)置在冰上，混勻。取适當量的細胞裂解緩沖液A，在使用前加入PMSF溶液和/或磷酸酶抑制劑（自(zì)備，試劑盒不提供）和1/1000體(tǐ)積的1 M DTT，随後立即放(fàng)于冰上待用。

組份	一次提取需要體(tǐ)積	PMSF溶液	1 M DTT	Benzonase
細胞裂解緩沖液A （步驟1.4.1和1.5.1）	800 μl	8 μl	0.8 μl	-
核蛋白(bái)提取試劑I（變性） （步驟1.6.1.2）	100 μl	1 μl	0.1 μl	1 μl
核蛋白(bái)提取試劑II（非變性）（步驟1.6.2.2）	50 μl	0.5 μl	-	-

1.2 準備細胞：

1.2.1 對于貼壁細胞：用PBS漂洗一遍，棄PBS；再加入适量PBS，用細胞刮刀刮下細胞，或用0.02% EDTA（0.5 mM）溶液處理(lǐ)細胞使細胞不再貼壁很緊，并用移液器吹打下細胞。450 g 4℃離(lí)心5 min收集細胞，盡最大(dà)努力吸盡上清，留下細胞沉澱備用。盡量避免用胰酶消化細胞，以免胰酶降解需抽提的目的蛋白(bái)。

1.2.2 對于懸浮細胞：450 g 4℃離(lí)心5 min收集細胞，用PBS洗一遍，離(lí)心收集細胞，盡最大(dà)努力吸盡上清，留下細胞沉澱備用。

1.3 按照(zhào)下表大(dà)體(tǐ)估算提取溶液使用體(tǐ)積：

注：(二百萬，2×10⁶)HeLa細胞，其細胞沉澱體(tǐ)積（PCV，Packed Cell Volume）大(dà)約爲20 μl。

1.4 胞漿蛋白(bái)提取：

1.4.1細胞沉澱中加入準備好的400 μl細胞裂解緩沖液A（含抑制劑和DTT），用1 ml吸頭吹打重懸細胞沉澱5-10次，把細胞沉澱完全懸浮并分(fēn)散開,冰浴5分(fēn)鍾。

1.4.2 加入20 μl 細胞裂解緩沖液B（按照(zhào)細胞裂解緩沖液A體(tǐ)積的1/20加入），混勻，冰浴5-10分(fēn)鍾。

        注1：此步驟盡量不要漩渦震蕩沉澱，否則得(de)到的細胞漿蛋白(bái)可(kě)能會污染核蛋白(bái)。

注2：裂解緩沖液對不同細胞的裂解能力有不同，敏感細胞裂解5分(fēn)鍾足夠，其他(tā)細胞冰浴時間不要超過10分(fēn)鍾。

1.4.3 4℃ 16000g 離(lí)心5分(fēn)鍾，取80%上清即爲胞漿蛋白(bái)，保存備用。

     注：吸取上清時千萬不要觸及沉澱，可(kě)以隻取80%體(tǐ)積上清，以免胞漿蛋白(bái)中污染細胞核。每5-10×10⁶細胞用400 μl細胞裂解緩沖液A裂解後獲得(de)的上清，其細胞漿蛋白(bái)濃度約爲1-2 μg/μl，不同細胞略有不同。

1.5 收集細胞核：

1.5.1 徹底去(qù)除步驟1.4.3離(lí)心管内上清，沉澱中再次加入400 μl細胞裂解緩沖液A（含PMSF和DTT），用1 ml吸頭吹打重懸沉澱至沉澱完全散開（注：渦旋震蕩不易懸浮沉澱），冰浴5分(fēn)鍾。

      注：此步驟目的是徹底漂洗沉澱中殘餘的未裂解細胞，可(kě)以大(dà)大(dà)提高細胞核的純度

1.5.2 4℃ 16000g 離(lí)心5-10分(fēn)鍾，徹底去(qù)除上清，沉澱即爲完整的細胞核。

注：盡量完全把上清去(qù)除幹淨，否則細胞核中會污染胞漿蛋白(bái)。

1.5.3 細胞核沉澱中加入50 μl細胞核貯存緩沖液，用吸頭完全重懸沉澱，得(de)到細胞核溶液。該溶液可(kě)以-80℃貯存。

1.5.4 可(kě)選步驟：取10 μl細胞核溶液，加入10 μl台盼藍染色液，混勻後，常溫放(fàng)置2分(fēn)鍾，顯微鏡下觀察細胞核的染色情況，提取良好的細胞核爲均一藍色，沒有粘連（如(rú)圖）。 pt;mso-ansi-language:EN-US; mso-fareast-language:ZH-CN;mso-bidi-language:AR-SA'>可(kě)選步驟：取10 μl細胞核溶液，加入10 μl台盼藍染色液，混勻後，常溫放(fàng)置2分(fēn)鍾，顯微鏡下觀察細胞核的染色情況，提取良好的細胞核爲均一藍色，沒有粘連（如(rú)圖）。

 1.6 細胞核蛋白(bái)提取：

1.6.1 變性核蛋白(bái)提取：

注：此步驟使用含有SDS的提取試劑B，完全裂解核膜，釋放(fàng)出細胞核内容物，提取的是完全變性的核蛋白(bái)，适用于SDS-PAGE電泳Western Blot檢測。

1.6.1.1 取一管50 μl細胞核溶液，4℃ 16000g 離(lí)心2分(fēn)鍾，去(qù)除上清，保留沉澱。

1.6.1.2 沉澱中加入100 μl核蛋白(bái)提取試劑I（變性）（含PMSF和DTT）和1 μl Benzonase，吸頭重懸沉澱，37℃處理(lǐ)30分(fēn)鍾至幾乎無可(kě)見(jiàn)不溶物。

注：加入核蛋白(bái)提取試劑I（變性）後，細胞核裂解釋放(fàng)出大(dà)量核酸，溶液非常粘稠，核酸酶Benzonase可(kě)以消化掉核酸，降低粘度。

1.6.1.3 4℃16,000g離(lí)心10分(fēn)鍾，立即吸取上清至一預冷(lěng)的離(lí)心管中，即爲抽提得(de)到的變性核蛋白(bái)。可(kě)以立即使用，也可(kě)以-80℃凍存。每5-10×10⁶細胞用100微升提取試劑B裂解後獲得(de)的上清，可(kě)以使用BCA蛋白(bái)濃度測定試劑盒（貨号：RTP7102）測定濃度，其核蛋白(bái)濃度約爲1-3 μg/μl，不同細胞略有不同。

1.6.2 非變性核蛋白(bái)提取：

注：此步驟使用高鹽緩沖液使得(de)細胞核收縮，核酸結合蛋白(bái)（如(rú)轉錄因子）與核酸分(fēn)離(lí)，擴散到細胞核外部，離(lí)心後上清中爲非變性（活性）核蛋白(bái)，适用EMSA，轉錄因子活性分(fēn)析等實驗。

1.6.2.1 取一管50 μl細胞核溶液，4℃ 16000g 離(lí)心2分(fēn)鍾，去(qù)除上清，保留沉澱。

1.6.2.2 沉澱中加入50 μl核蛋白(bái)提取試劑II（非變性）（含PMSF，不要添加DTT），吸頭重懸沉澱，4℃旋轉混勻30 min，至最後得(de)到的溶液無可(kě)見(jiàn)懸浮物。

       注：如(rú)不能旋轉混勻，可(kě)以冰浴30 min，每隔5分(fēn)鍾混勻一次。

1.6.2.3 4℃16,000g離(lí)心10分(fēn)鍾，立即吸取上清至一預冷(lěng)的離(lí)心管中，即爲抽提得(de)到的活性核蛋白(bái)。可(kě)以立即使用，也可(kě)以-80℃凍存。每5-10×10⁶細胞用50微升核蛋白(bái)提取試劑II（非變性）裂解後獲得(de)的上清，可(kě)以使用BCA蛋白(bái)濃度測定試劑盒（貨号：RTP7102）測定濃度，其細胞核蛋白(bái)濃度約爲1-3 μg/μl，不同細胞略有不同。

二 關于胞漿蛋白(bái)和核蛋白(bái)産量和質量的評價：

2.1蛋白(bái)産量：

2.2 胞漿蛋白(bái)和核蛋白(bái)質量評價：

蛋白(bái)分(fēn)區提取的質量評價首先看(kàn)提取的蛋白(bái)是否是分(fēn)區蛋白(bái)，其次要看(kàn)分(fēn)區蛋白(bái)是否有明顯的富集，其三要看(kàn)提出的分(fēn)區蛋白(bái)是否有其他(tā)組分(fēn)交叉污染，最後看(kàn)提取的分(fēn)區蛋白(bái)中是否可(kě)以檢測出目的蛋白(bái)。使用專門(mén)的胞漿内參和細胞核檢測（下表），可(kě)以初步确認提出的是胞漿蛋白(bái)還(hái)是核蛋白(bái)。蛋白(bái)是否有效富集需要用總蛋白(bái)作(zuò)爲對照(zhào)，與總蛋白(bái)相(xiàng)比，胞漿蛋白(bái)内參或核内參是否有明顯富集。交叉污染可(kě)以用其他(tā)組分(fēn)内參檢測蛋白(bái)樣品，如(rú)關注胞漿蛋白(bái)中是否有細胞核蛋白(bái)污染，可(kě)以使用核蛋白(bái)内參如(rú)Lamin B1檢測胞漿蛋白(bái)，檢測無條帶即說(shuō)明胞漿蛋白(bái)與細胞核組分(fēn)無交叉污染。用目标蛋白(bái)抗體(tǐ)檢測分(fēn)區蛋白(bái)，驗證是否可(kě)以檢測到目的蛋白(bái)，蛋白(bái)大(dà)小是否符合預期。

三 實驗示例：

 

  

Jurkat總蛋白(bái)，細胞漿蛋白(bái)，細胞核蛋白(bái)GAPDH檢測

總蛋白(bái)提取：4×10⁶ K562細胞，400 g 離(lí)心收集，去(qù)上清，沉澱中加入200 μl RIPA（加2 μl 100 mM PMSF），冰上裂解5分(fēn)鍾，4℃ 16000 g 15 分(fēn)鍾，上清即爲總蛋白(bái)（TP）。

細胞漿蛋白(bái)：4×10⁶ K562細胞，400 g 離(lí)心收集，加入400 μl細胞裂解緩沖液A （加4 μl 100mM PMSF，加0.4 μl 1 M DTT），懸浮沉澱，冰浴5分(fēn)鍾；加入20 μl細胞裂解緩沖液B，混勻，冰上孵育5分(fēn)鍾，4℃ 16000g 5分(fēn)鍾，小心收集上清即爲細胞漿蛋白(bái)（CP），不要觸及沉澱。

細胞核蛋白(bái)提取：沉澱中計(jì)入100 μl核蛋白(bái)提取試劑I（變性），1 μl Benzonase，37℃ 30 min，4 ℃ 16000 g 10分(fēn)鍾，上清即爲細胞核蛋白(bái)（NP）。

電泳：RTD6117-0420  200V 33-12 mA 55 min

轉膜：NC膜，1×RealBlot快(kuài)速轉膜液濕轉，穩流400 mA，電壓變化64-57 V，轉膜時間35 min

封閉：無蛋白(bái)快(kuài)速封閉液RT 10 min

一抗孵育；二抗孵育；檢測：ECL發光(guāng)檢測