TBE-PAGE電泳可(kě)以選擇PAGE電泳Marker 作(zuò)爲分(fēn)子量标準。                   

                  DNA非變性PAGE電泳試劑盒（貨号RTE4101）  

                       DNA Native PAGE Electrophoresis Kit

● 産品組成：

● 産品簡介：

非變性 PAGE 電泳是研究DNA構象變化的常用手段，在非變性條件(jiàn)下DNA的泳動與電荷、片段大(dà)小、DNA結合的蛋白(bái)及折疊構象都(dōu)有關系。非變性PAGE電泳是研究單鏈 PCR片段構象多态性（SSCP-PCR，single-strand conformation  polymorphism-PCR）的重要研究手段。在SSCP測定中，雙鏈DNA（dsDNA）變性爲單鏈DNA（ssDNA），每一條單鏈DNA都(dōu)基于他(tā)們的内部序列呈現不同的折疊構象，即使相(xiàng)同長度的單鏈DNA因其堿基順序不同，甚至單個堿基的不同都(dōu)會形成不同的構象。這些不同構象的ssDNA 在非變性PAGE中得(de)到分(fēn)離(lí)。另外，非變性PAGE還(hái)可(kě)以分(fēn)離(lí)小片段的雙鏈DNA，與瓊脂糖電泳相(xiàng)比，對低于500bp的雙鏈DNA片段有更優秀的分(fēn)辨率。

本公司提供的DNA非變性PAGE電泳試劑盒包含凝膠制備及電泳所需的全部試劑，用戶隻需自(zì)備制膠器具和蒸餾水，即可(kě)配制各種濃度的PAGE膠，使用方便。

本試劑盒大(dà)約可(kě)以配制20-45塊常規大(dà)小（8×10cm）PAGE凝膠，具體(tǐ)數量根據凝膠厚度決定：0.75mm厚度凝膠可(kě)以配制45塊膠，1mm厚度凝膠可(kě)以配制至少35塊膠，1.5mm厚度凝膠可(kě)以配制至少20塊膠。

● 貯存和效期：

   本産品常溫運輸，按照(zhào)标簽溫度貯存；有效期一年(nián)。

● 使用說(shuō)明：

10% APS配制-5 ml：

将0.5 gAPS幹粉溶于5 ml滅菌水中，徹底溶解後分(fēn)裝，1 ml/支，-20℃備存，每次取一管使用。10% APS應盡量減少室溫存放(fàng)時間，以防失效。10%APS在4℃有效期爲一周，-20℃有效期6個月。若發現凝膠聚合時間延長，應考慮更換使用-20度保存的10% APS。

一、制備凝膠步驟：（以下步驟爲制備8×10cm厚度1.0mm膠）

1.1 參照(zhào)凝膠模具說(shuō)明書(shū)，裝配好凝膠模具。

1.2按照(zhào)表一将不同體(tǐ)積的成分(fēn)在小燒杯或試管中混合；最後加入10%APS和TEMED，輕輕攪拌使其混勻，避免産生(shēng)氣泡。

1.3在凝膠模具中灌入适量分(fēn)離(lí)膠溶液（對于mini-gel，凝膠液加至約距前玻璃闆頂端1.5 cm或距梳齒約0.5 cm即可(kě)），然後在分(fēn)離(lí)膠溶液上輕輕覆蓋一層1-5 cm的水層，使凝膠表面保持平整。

1.4靜(jìng)置10-20分(fēn)鍾，待分(fēn)離(lí)膠和水層之間出現一個清晰的界面後，說(shuō)明凝膠已聚合

表一 TBE-PAGE分(fēn)離(lí)膠配方表 (總體(tǐ)積5 ml，适用于厚度1.0 mm小闆膠)

注：凝膠的聚合時間與環境溫度有關。夏天溫度較高時，聚合較快(kuài)；冬天氣溫低時，聚合時間會延長。可(kě)以根據環境溫度的不同調節APS的加入量。

1.5去(qù)除覆蓋在分(fēn)離(lí)膠上的水層；按照(zhào)表二将不同體(tǐ)積成分(fēn)在一個小燒杯或試管中混合；最後加入10%過硫酸铵和TEMED，輕輕攪拌使其混勻，避免産生(shēng)氣泡。

表二 TBE-PAGE 4%濃縮配方表 (總體(tǐ)積1.5 ml，适用于1.0mm厚度膠)

1.6将濃縮膠溶液加至分(fēn)離(lí)膠的上面，直至凝膠溶液到達前玻璃闆的頂端；将梳子插入凝膠内，避免産生(shēng)氣泡。

1.7靜(jìng)置30-60分(fēn)鍾，等待濃縮膠聚合。

注：凝膠的聚合時間與環境溫度有關。夏天溫度較高時，聚合較快(kuài)；冬天氣溫低時，聚合時間會延長。可(kě)以根據環境溫度的不同調節APS的加入量。

二、電泳：

2.1 1×TBE電泳液配制：取100ml 5×TBE，加蒸餾水400 ml，即配成500 ml 1×TBE。将凝膠闆固定在電泳裝置上，往上槽和下槽中加入足夠1×TBE電泳液。 用1ml吸頭沖洗加樣孔1-2次。

2.2 取待測樣品，加入相(xiàng)應體(tǐ)積6×Native PAGE DNA上樣液，如(rú)5 μl樣品加1 μl 上樣液，短(duǎn)暫離(lí)

心後取5-10 μl上樣。TBE-PAGE中判斷雙鏈DNA大(dà)小可(kě)以選擇20bp DNA ladder（貨号：RTM441）作(zuò)爲DNA Marker。

2.3 連接電源線，打開電源開關。200 V穩壓電泳。至二甲苯菁指示前沿到達凝膠三分(fēn)之二位置時結束電泳。

三、染色：

3.1 漂洗：玻璃闆上拆下凝膠後，适量蒸餾水漂洗3-5分(fēn)鍾。

3.2 染色液配制：

  TBE-PAGE膠可(kě)以使用EB或RealSafe類染料後染染色，以下程序用RealSafe Red核酸染料進行染色。即用型染色液配制：

3.3染色：

五、常見(jiàn)問(wèn)題：

1. 爲何 SSCP-PCR帶型有複合條帶？

原因之一：可(kě)能是殘留的 PCR 引物跟單鏈的 DNA 結合形成遷移率不同的條帶。解決方法是稀釋PCR或電泳前将PCR産物進行純化。

原因之二：可(kě)能是PCR産物用量過高，彼此複性。解決辦法是将PCR産物稀釋後4-8倍後使用。 

2. 如(rú)何提高電泳分(fēn)辨率？

實驗示例