土(tǔ)壤基因組DNA提取試劑盒
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貨号
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産品名稱
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規格
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RTG2403
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土(tǔ)壤基因組DNA提取試劑盒
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50次
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● 試劑盒内容及保存：
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試劑盒組成
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RTG2403（50次）
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貯存方式
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緩沖液R1
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40
ml
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常溫
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緩沖液R2
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6
ml
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常溫
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緩沖液R3
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6 ml
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常溫
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緩沖液R4
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10
ml
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常溫
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緩沖液 R5（濃縮液）
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15
ml
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常溫
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漂洗緩沖液WB1（濃縮液）
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14
ml
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常溫
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漂洗緩沖液PW (濃縮液)
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13
ml
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常溫
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洗脫液EB
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15
ml
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常溫
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Glass
beads
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20 g
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常溫
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吸附柱CG
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50個
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常溫
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收集管（2
ml）
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50個
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常溫
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說(shuō)明書(shū)
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1份
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● 儲存條件(jiàn)和效期：
本試劑盒在室溫（25℃左右）幹燥條件(jiàn)下，可(kě)保存1年(nián)。緩沖液R2和R3可(kě)能有沉澱産生(shēng)，若溶液産生(shēng)沉澱，應在使用前置于37℃下溶解沉澱至溶液澄清後再使用。
● 産品簡介：
土(tǔ)壤樣品存在大(dà)量的抑制因子如(rú)腐殖酸、金屬離(lí)子等，而純化的DNA 中隻要有這些微量物質的存在，都(dōu)會影(yǐng)響到PCR等酶促反應。本公司的土(tǔ)壤試劑盒采用獨特的腐殖酸去(qù)除液（緩沖液R2）能夠有效去(qù)除腐殖酸；吸附柱CG能能有效去(qù)除金屬等抑制因子，提純得(de)到的基因組DNA可(kě)直接用于PCR
反應，酶切或定量實驗。
● 準備工(gōng)作(zuò)：
1. 準備55℃，70℃水浴；無水乙醇；異丙醇；制冰機(jī)；1.5ml離(lí)心管；2ml離(lí)心管
2. 按照(zhào)标簽所示在漂洗緩沖液WB1和漂洗緩沖液PW中加入無水乙醇；緩沖液R5中加入異丙醇，混勻後蓋緊瓶蓋後室溫貯存備用。
3. 每次使用前請(qǐng)檢查緩沖液R2，緩沖液R3是否有沉澱生(shēng)成，如(rú)果出現沉澱，37℃溫浴至沉澱溶解後再使用。
● 标準操作(zuò)步驟：
如(rú)非指出，所有離(lí)心步驟均爲使用台式離(lí)心機(jī)在室溫下離(lí)心。
1. 稱0.3-0.5 g土(tǔ)壤置于2ml離(lí)心管中，加入0.4gGlass Beads，再加入700 μl 緩沖液R1與100
μl 緩沖液R2。渦旋器高速震蕩3-5min。
注意：對含水量豐富的樣品，可(kě)以預先離(lí)心除去(qù)部分(fēn)水分(fēn)後再稱取樣品。緩沖液R2是腐殖酸去(qù)除劑，100μl對大(dà)部分(fēn)樣品來(lái)說(shuō)足以有效除去(qù)腐殖酸等抑制因子。對一些腐殖酸含量特别豐富的土(tǔ)壤， 緩沖液R2的量可(kě)以适當增加，但(dàn)不能超過250μl，否則會嚴重影(yǐng)響DNA的得(de)率。
2. 加入100
μl 緩沖液R3（R3如(rú)有沉澱37℃水浴完全溶解後再用），渦旋混勻。70℃水浴處理(lǐ)10min。期間振蕩幾次。注意：如(rú)果要純化革蘭氏陽性菌的DNA，請(qǐng)在70℃處理(lǐ)完後，再90℃水浴處理(lǐ)2min。
3. 12000 rpm(~13,000g)離(lí)心1分(fēn)鍾,取600μl上清到1.5ml離(lí)心管中，加入180 μl 緩沖液R4混勻。
注：轉移上清時确保不要吸取到沉澱，轉移的上清量最好不超過80%。
4. 冰上放(fàng)置5分(fēn)鍾。12000 rpm(~13,000g)離(lí)心1分(fēn)鍾。
轉移上清到新的1.5ml離(lí)心管中。
注：轉移上清時确保不要吸取到沉澱，轉移的上清量最好不超過80%。
5. 加入與上清等體(tǐ)積的緩沖液R5（使用前請(qǐng)檢查是否已加入異丙醇），颠倒混勻。
6. 取750 μl混合液加到吸附柱中（吸附柱放(fàng)入收集管中），12000 rpm(~13,000g)離(lí)心30秒，倒掉濾出液。
7. 将剩餘混合液加到吸附柱中(吸附柱放(fàng)入收集管中),12000rpm(~13,000g)離(lí)心30秒,倒掉濾過液。
8. 向吸附柱CG中加入500
μl 漂洗緩沖液WB1(使用前請(qǐng)先檢查是否已加入無水乙醇),12,000
rpm (~13,000×g ) 離(lí)心30
秒，倒掉廢液。
9. 向吸附柱CG中加入600
μl 漂洗緩沖液PW(使用前請(qǐng)先檢查是否已加入無水乙醇)，12,000
rpm (~13,000g) 離(lí)心30
秒，倒掉廢液，吸附柱CG放(fàng)入收集管中。
10. 向吸附柱CG中加入600
μl漂洗緩沖液PW，12,000
rpm (~13,000g) 離(lí)心30秒，倒掉廢液，将吸附柱CG放(fàng)入收集管中。
11. 12,000 rpm(~13,000g)離(lí)心2分(fēn)鍾，以徹底晾幹吸附材料中殘餘的漂洗液。
注：此步驟非常重要，其目的是将吸附柱中殘餘的漂洗液去(qù)除。漂洗液中乙醇的殘留會影(yǐng)響後續的酶反應（酶切、PCR等）實驗。
12. 将吸附柱CG轉入一個幹淨的1.5ml離(lí)心管中，向吸附膜的中間部位懸空滴加50–100
μl經70℃水浴預熱(rè)的洗脫緩沖液EB，室溫放(fàng)置2分(fēn)鍾，12,000 rpm(~13,000g)離(lí)心2分(fēn)鍾。
注: = 1 \* GB3 ① 洗脫緩沖液體(tǐ)積最好不少于50 μl，體(tǐ)積過小影(yǐng)響回收效率。
= 2 \* GB3 ② 洗脫液的pH值對于洗脫效率有很大(dà)影(yǐng)響。若用水做洗脫液應保證其pH值在7.0-8.5範圍内，pH值低于7.0會降低洗脫效率。
13.
DNA産物-20℃保存。
大(dà)量操作(zuò)步驟（針對含微量核酸的樣品）
1. 稱1-5
g土(tǔ)壤置于10ml離(lí)心管中，加入1gGlass Beads，再加入3ml
緩沖液R1與200μl
緩沖液R2。渦旋器高速震蕩3-5分(fēn)鍾。
2.
加入600μl
緩沖液R3，渦旋混勻。70℃水浴處理(lǐ)10分(fēn)鍾。期間振蕩幾次。
3.3000g離(lí)心3分(fēn)鍾，轉移上清到新的離(lí)心管中，加入550μl
緩沖液R4混勻。
4.
冰上放(fàng)置5分(fēn)鍾。8000
g離(lí)心10分(fēn)鍾。轉移上清到新的離(lí)心管中。
5.
以下按标準操作(zuò)步驟的第五步繼續操作(zuò)。
● DNA濃度及純度檢測：
基因組DNA片段的大(dà)小與樣品保存時間、操作(zuò)過程中的剪切力等因素有關。提取的DNA片段可(kě)用瓊脂糖凝膠電泳和紫外分(fēn)光(guāng)光(guāng)度計(jì)檢測濃度與純度。可(kě)配制0.8-1.0％瓊脂糖凝膠，使用λ/HindIII判斷基因組的大(dà)小，完整的基因組大(dà)小應在23kb以上。使用分(fēn)光(guāng)光(guāng)度計(jì)檢測時， OD260/OD280比值應爲1.7–1.9之間，如(rú)果洗脫時不使用洗脫緩沖液，而使用去(qù)離(lí)子水洗脫，比值可(kě)能偏低，但(dàn)并不表明DNA純度不高。
● 常見(jiàn)問(wèn)題分(fēn)析：
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常見(jiàn)問(wèn)題
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可(kě)能原因
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建議(yì)
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沒有洗脫出DNA
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緩沖液R5沒有加入異丙醇
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樣品過柱前，必須用異丙醇調整核酸結合條件(jiàn)，否則核酸不能挂柱。
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漂洗緩沖液PW中沒有加入乙醇
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漂洗緩沖液PW使用前請(qǐng)按照(zhào)标簽加入無水乙醇。無水乙醇加入量不正确會導緻核酸提取量大(dà)大(dà)降低。
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低濃度的DNA量
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緩沖液R2使用過量
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按照(zhào)步驟1加入适量緩沖液R2
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洗脫體(tǐ)積太小
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洗脫體(tǐ)積不能低于50μl，如(rú)洗脫體(tǐ)積太小，回收率将大(dà)大(dà)降低。
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洗滌不恰當
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漂洗緩沖液PW使用前請(qǐng)按照(zhào)标簽加入無水乙醇。無水乙醇加入量不正确會導緻核酸提取量大(dà)大(dà)降低。
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低A260/A280比率
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蛋白(bái)污染
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不要忽略步驟8中用漂洗緩沖液WB1沖洗吸附柱
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洗脫液pH值不合适
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确保使用的洗脫液pH在8.0以上，如(rú)低于8.0将導緻DNA洗脫量過低。
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下遊應用不好
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提取的DNA含鹽量高
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漂洗緩沖液PW使用前請(qǐng)按照(zhào)标簽加入無水乙醇。
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提取的DNA含有乙醇
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步驟11空甩柱子2分(fēn)鍾非常關鍵，徹底去(qù)除漂洗液中的乙醇。
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抑制PCR反應
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增加緩沖液R2用量，徹底去(qù)除腐殖酸等PCR抑制因子；步驟4中确保不要吸取到沉澱。
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實驗示例：
Buffer R2去(qù)除腐殖酸效果對比圖
左圖-步驟1提取時使用了Brffer R2，顔色明顯淺很多(左1,左2)，
說(shuō)明Buffer R2對去(qù)除腐殖酸、色素等效果明顯
右圖-步驟3上清加入Buffer R4進一步處理(lǐ)，離(lí)心去(qù)除雜質，
裂解時加有Buffer R2的，再經Buffer R4處理(lǐ)幾乎不再有顔色(右1,右2)，
而不加Buffer R2的顔色還(hái)很深(右3，右4)。
1, 2: SDS高鹽酚氯仿抽提法
3, 4: 土(tǔ)壤基因組DNA提取試劑盒(RTG2403)提取
1, 3: 爲花基土(tǔ)壤
2, 4: 河邊淤泥
核酸提取産品發表文章(zhāng)
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