pfu DNA Polymerase
高保真平末端DNA聚合酶
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目錄号
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包裝
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貯存
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RTH3102-02
RTH3102-03
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100U
5×100U
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-20℃
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● 貯存
-20℃保存一年(nián)。
● 産品簡介
pfu DNA Polymerase是嗜熱(rè)古細菌來(lái)源的DNA聚合酶，該酶除具有5’-3’DNA聚合酶活性外，還(hái)具有很強的3’-5’外切酶活性，增強了PCR擴增的保真度。與Taq酶相(xiàng)比，pfu聚合酶熱(rè)穩定性更好，更能忍耐較高的變性溫度。Pfu的保真性是Taq
DNA聚合酶的10-15倍。延伸速度爲0.5kb/分(fēn)鍾。PCR産物3’端不帶堿基A，爲平滑末端，要通過平滑末端克隆法進行克隆。
● 産品組成（RTH3102-02）
pfu DNA
Polymerase（2.5U/μl） 40μl
10×pfu
PCR buffer（含Mg2＋） 0.5 ml
● 活性定義
1單位(U) pfu DNA Polymerase活力定義爲在74℃、30分(fēn)鍾内，以活性化的大(dà)馬哈魚精子DNA作(zuò)爲模闆/引物，将10 nmol脫氧核苷酸摻入到酸不溶物質所需的酶量。
● 酶貯存緩沖液
50 mM Tris-HCl (pH 8.0);0.1 mMEDTA;1 mMDTT;50 mMKCl ; Stabilizers; 50% glycerol
● 适用範圍
高保真的DNA片段的擴增、DNA片段的平滑化。
● 使用說(shuō)明：
1. 按照(zhào)下表在0.2ml PCR管中制備反應體(tǐ)系：
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成分(fēn)
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20μl反應體(tǐ)系
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50μl反應體(tǐ)系
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終濃度
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Template
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0.04-0.2 μg
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0.1-0.5 μg
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as you wish
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Primer 1（10 μM）
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0.4 μl
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1 μl
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0.2 μM
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Primer 2（10μM）
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0.4 μl
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1 μl
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0.2 μM
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10×pfu PCR buffer(含Mg2+)
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2 μl
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5 μl
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1×
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dNTP Mixture(10 mM)
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0.4 μl
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1 μl
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200 μM each
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pfu (2.5 U/μl)
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0.4 μl
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1 μl
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0.05U/μl
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ddH2O
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up to 20 μl
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up to 50 μl
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-
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注1：如(rú)果需要改變Mg2+濃度，根據下表調節
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PCR反應體(tǐ)系中Mg2+終濃度
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2 mM
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2.5 mM
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3 mM
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4 mM
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20μl反應體(tǐ)系中25 mM MgSO4加入量
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0 μl
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0.4 μl
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0.8 μl
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1.6 μl
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50μl反應體(tǐ)系中25 mM MgSO4加入量
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0 μl
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1 μl
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2 μl
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4 μl
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注2：配制反應液時，請(qǐng)最後加入pfu，因爲本酶有很強的3’-5’外切酶活性，有可(kě)能降解引物。
2. 混勻後，離(lí)心快(kuài)甩将反應液收集到管底。
3. PCR儀如(rú)果沒有熱(rè)蓋加熱(rè)的話(huà)，補加25μl礦物油。
4. PCR儀上執行以下程序：
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步驟
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溫度
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時間
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循環數
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初始變性
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94℃
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3-5 min
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1
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變性
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94℃
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30 sec
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25-40*
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退火(huǒ)
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50-60℃*
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30 sec
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延伸
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72℃
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0.5kb/min*
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最後延伸
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72℃
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5 min
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1
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*注： PCR 反應條件(jiàn)視模闆、引物等的結構條件(jiàn)不同而各異。在實際操作(zuò)中需根據模闆、目的片段的大(dà)小、堿基序列和引物的長短(duǎn)等具體(tǐ)情況，設定最佳的反應條件(jiàn)（溫度、時間等）。
● 注意事(shì)項
1. pfu 酶具有 3’-5’的外切酶活性，所以 pfu 酶擴增時延伸速度遠(yuǎn)比 Taq 酶低，應根據擴增産物的長度設置相(xiàng)應的延伸時間，一般情況下 pfu 酶的延伸速度爲每分(fēn)鍾 0.5kb；同時 pfu 酶的 3’-5’的外切酶活性可(kě)能降解引物，所以應最後把pfu 酶到反應體(tǐ)系中，并立即進行 PCR 反應。
2. pfu 酶的熱(rè)穩定性比 Taq 酶好，對于 GC 含量很高的模闆，變性溫度可(kě)以提高到98℃，對 pfu 酶的活性無影(yǐng)響。
● 使用舉例：
水稻基因組做模闆