20bp
DNA ladder
● 産品編号及規格:
RTM441
50次 (250 μl)
● 産品組成:
貨号
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名稱
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規格
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RTM441-01
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20bp DNA ladder
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50次(250 μl)
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DL070
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6×Native-PAGE DNA上樣緩沖液
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1 ml
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DL020
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6×DualColor DNA
loading buffer (雙染料)
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1 ml
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● 産品簡介:
本産品是由13條帶狀雙鏈DNA條帶組成的精準定量Marker,适用于聚丙烯酰胺凝膠電泳中DNA條帶大(dà)小和含量的分(fēn)析。13條帶的大(dà)小分(fēn)别爲20,40,60,80,100,120,140,160,180,200,300,400,500
bp。其中100bp和200bp條帶爲加亮帶,含量爲100ng/5μl,其餘條帶濃度爲50ng/5μl。
本産品爲雙鏈DNA
Marker,适用于非變性的PAGE電泳和瓊脂糖凝膠電泳,不适用于尿素PAGE電泳。由于片段較小,如(rú)使用瓊脂糖分(fēn)離(lí),建議(yì)使用高分(fēn)辨率瓊脂糖凝膠電泳分(fēn)離(lí)。
按照(zhào)每次上樣5
μl計(jì)算,該産品可(kě)以使用50次。
● 儲存條件(jiàn):
4℃ 貯存6個月(-20℃長期貯存)。
● 使用方法:
一、 TBE-PAGE凝膠分(fēn)離(lí):
1、制備凝膠步驟:
1.1參照(zhào)凝膠模具說(shuō)明書(shū),裝配好凝膠模具。
1.2按照(zhào)表一将不同體(tǐ)積的成分(fēn)在小燒杯或試管中混合;最後加入10%APS和TEMED,輕輕攪拌使其混勻,避免産生(shēng)氣泡。
注:20bp DNA ladder 适用于配制20%TBE-PAGE膠。
1.3在凝膠模具中灌入适量分(fēn)離(lí)膠溶液(對于mini-gel,凝膠液加至約距前玻璃闆頂端1.5 cm或距梳齒約0.5 cm即可(kě)),然後在分(fēn)離(lí)膠溶液上輕輕覆蓋一層1-2 cm的無水乙醇,使凝膠表面保持平整。
1.4靜(jìng)置10-20分(fēn)鍾,待分(fēn)離(lí)膠和乙醇層之間出現一個清晰的界面後,說(shuō)明凝膠已聚合
表一 TBE-PAGE分(fēn)離(lí)膠配方表 (總體(tǐ)積5 ml,适用于1mm厚度小闆膠)
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各組份體(tǐ)積(ml)
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最佳DNA分(fēn)離(lí)範圍
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凝膠濃度
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滅菌水
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30%PAA(29:1)
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5×TBE
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10%APS
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TEMED
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70-450 bp
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6%
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3
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1.0
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1.0
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0.05
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0.005
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60-460 bp
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8%
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2.66
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1.34
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1.0
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0.05
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0.005
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50-300 bp
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10%
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2.33
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1.67
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1.0
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0.05
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0.005
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40-200 bp
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12%
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2
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2.0
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1.0
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0.05
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0.005
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25-150 bp
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15%
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0.5
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2.5
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1.0
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0.05
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0.005
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5-100 bp
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20%
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0.66
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3.34
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1.0
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0.05
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0.005
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1.5去(qù)除覆蓋在分(fēn)離(lí)膠上的乙醇;按照(zhào)表二将不同體(tǐ)積成分(fēn)在一個小燒杯或試管中混合;最後加入10%過硫酸铵和TEMED,輕輕攪拌使其混勻,避免産生(shēng)氣泡。
表二 TBE-PAGE 4%濃縮配方表 (總體(tǐ)積1.5 ml,适用于1mm厚度小闆膠)
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各組份體(tǐ)積(ml)
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凝膠濃度
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滅菌水
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30%PAA(29:1)
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5×TBE
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10%APS
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TEMED
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4%
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1.0
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0.2
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0.3
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0.02
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0.002
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1.6将濃縮膠溶液加至分(fēn)離(lí)膠的上面,直至凝膠溶液到達前玻璃闆的頂端;将梳子插入凝膠内,避免産生(shēng)氣泡。
1.7靜(jìng)置30-60分(fēn)鍾,等待濃縮膠聚合。
注:凝膠的聚合時間與環境溫度有關。夏天溫度較高時,聚合較快(kuài);冬天氣溫低時,聚合時間會延長。可(kě)以根據環境溫度的不同調節APS的加入量。
2、電泳:
2.1 将凝膠闆固定在電泳裝置上,往上槽和下槽中加入1×TBE電泳液,1 ml吸頭沖洗加樣孔1-2次。
2.2 取待測樣品,加入相(xiàng)應體(tǐ)積6×Native PAGE DNA上樣緩沖液,如(rú)5 μl樣品加1 μl 上樣緩沖液,短(duǎn)暫離(lí)心後取5-10 μl上樣。 20bp DNA
ladder 1 mm厚10齒梳子上樣5 μl,其餘梳齒和厚度凝膠适量調整上樣量。
2.3 連接電源線,打開電源開關。200V穩壓電泳。至二甲苯菁指示前沿到達凝膠三分(fēn)之二位置時結束電泳(此時溴酚藍指示前沿已經跑出凝膠,不可(kě)見(jiàn))。
TBE-PAGE電泳
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恒電壓
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起始電流
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結束電流
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電泳時間
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200
V
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20-25 mA/闆膠
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10-15
mA/闆膠
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70+min
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3、染色:
3.1 漂洗:玻璃闆上拆下凝膠後,适量蒸餾水漂洗3-5分(fēn)鍾。
3.2 染色液配制:
TBE-PAGE膠可(kě)以使用EB或RealSafe類染料後染染色,以下程序用RealSafe Red核酸染料(貨号:GR002)進行染色。即用型染色液配制:
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即用型RealSafe核酸染色液
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100 ml
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1×TBE
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100 ml
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RealSafe Red核酸染料
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20 μl
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3.3染色和觀察:
凝膠浸泡于即用型染色液中,常溫避光(guāng)搖床40-60 rpm染色30 分(fēn)鍾。紫外光(guāng)下觀察。
二、 瓊脂糖凝膠分(fēn)離(lí):
1. 瓊脂糖凝膠制備:
由于片段較小,建議(yì)選用高分(fēn)辨率瓊脂糖(貨号AR1036)制膠。
以下步驟以制備50
ml 3%凝膠爲例:
稱取1.5
g瓊脂糖于玻璃三角瓶中,加入50
ml 1×TAE,5 μl RealSafe Red核酸染料或其他(tā)核酸染料(如(rú)EB,GoldView),混勻,蓋好瓶蓋,微波爐中火(huǒ)加熱(rè)至沸騰,輕搖混勻,重複1-2次至瓊脂糖完全溶解,無可(kě)見(jiàn)顆粒。倒入制膠容器中,插好梳子,常溫凝固30-50分(fēn)鍾至凝膠完全凝固。
2. 電泳:
取待測樣品,加入相(xiàng)應體(tǐ)積6×DualColor
DNA loading buffer,如(rú)10 μl樣品加2 μl 上樣緩沖液,短(duǎn)暫離(lí)心後取5-10 μl上樣。 20bp DNA ladder 1 mm厚10齒梳子上樣5 μl,其餘梳齒和厚度凝膠适量調整上樣量。
建議(yì)電泳條件(jiàn):凝膠濃度爲3%,電泳電壓8-10
v/cm(單位電壓指電泳槽陰陽極之間的距離(lí)電壓,如(rú)陰極陽極之間的距離(lí)爲20 cm,可(kě)以用160-200
V電壓進行穩壓電泳),待溴酚藍指示前沿距離(lí)凝膠末端2 cm時終止電泳,電泳時間35-40分(fēn)鍾。
注:3% 瓊脂糖TAE電泳中,溴酚藍大(dà)小約爲20bp,二甲苯菁大(dà)小約200bp。
3. 紫外燈下觀察條帶。
注:使用EB或Goldview染料時,由于染料本身(shēn)帶正電荷較多,随着電泳時間的延長,染料會向陰極聚集,導緻小片段核酸結合的染料含量降低,會出現小片段的DNA片段紫外燈下亮度變弱或不可(kě)見(jiàn)。此時可(kě)以将膠浸泡于含有染料的1×TAE緩沖液中染色15-20分(fēn)鍾即可(kě)看(kàn)到小片段。
4. 實驗示例:
使用RTM441
20bp DNA ladder産品發表部分(fēn)文章(zhāng)列表:
1. [2022 IF=6] A novel ?uorescent sensor
based on aptamer recognition and DNA walker ampli?cation strategy and its
determination of 17b-estradiol.
Author: Yajun Zhang, Licong Jia, Wei Wang,
Meng Jiang, Hongying Zhang, LingMei Niu
Marker: RTM441,20bp
DNA ladder
Journal: Arabian Journal of Chemistry. 16
(2023) 105340.
Institution:School of Public Health, Hebei Medical
University
Paper link:https://doi.org/10.1016/j.arabjc.2023.105340