25bp
DNA ladder
● 産品編号及規格：
RTM444
50次 (250 μl)
● 産品組成：
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貨号
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名稱
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規格
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RTM444-01
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25bp DNA ladder
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50次（250 μl）
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DL070-01
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6×Native-PAGE DNA上樣緩沖液
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1 ml
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DL020-01
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6×DualColor DNA
loading buffer (雙染料)
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1 ml
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● 産品簡介：
本産品是由8條帶狀雙鏈DNA條帶組成的精準定量Marker，适用于聚丙烯酰胺凝膠電泳中DNA條帶大(dà)小和含量的分(fēn)析。8條帶的大(dà)小分(fēn)别爲25，50，100，150，200，300，400，500bp。其中200bp
bp條帶爲加亮帶，含量爲100ng/5μl，其餘條帶濃度爲50ng/5μl。
本産品爲雙鏈DNA
Marker，适用于非變性的PAGE電泳和瓊脂糖凝膠電泳，不适用于尿素PAGE電泳。由于片段較小，如(rú)使用瓊脂糖分(fēn)離(lí)，建議(yì)使用高分(fēn)辨率瓊脂糖凝膠電泳分(fēn)離(lí)。
按照(zhào)每次上樣5
μl計(jì)算，該産品可(kě)以使用50次。
● 儲存、效期及運輸：
4℃ 貯存6個月（-20℃有效期3年(nián)）；濕冰運輸。
● 使用方法：
一、 TBE-PAGE凝膠分(fēn)離(lí)：
1.1制備凝膠步驟：
1.1.1參照(zhào)凝膠模具說(shuō)明書(shū)，裝配好凝膠模具。
1.1.2按照(zhào)表一将不同體(tǐ)積的成分(fēn)在小燒杯或試管中混合；最後加入10%APS和TEMED，輕輕攪拌使其混勻，避免産生(shēng)氣泡。
注：25bp DNA ladder适用于配制15%TBE-PAGE膠。
1.1.3在凝膠模具中灌入适量分(fēn)離(lí)膠溶液（對于mini-gel，凝膠液加至約距前玻璃闆頂端1.5 cm或距梳齒約0.5 cm即可(kě)），然後在分(fēn)離(lí)膠溶液上輕輕覆蓋一層1-2 cm的無水乙醇，使凝膠表面保持平整。
1.1.4靜(jìng)置10-20分(fēn)鍾，待分(fēn)離(lí)膠和乙醇層之間出現一個清晰的界面後，說(shuō)明凝膠已聚合
表一 TBE-PAGE分(fēn)離(lí)膠配方表 (總體(tǐ)積5 ml，适用于1mm厚度小闆膠)
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各組份體(tǐ)積（ml）
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最佳DNA分(fēn)離(lí)範圍
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凝膠濃度
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滅菌水
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30%PAA（29：1）
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5×TBE
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10%APS
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TEMED
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70-450 bp
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6%
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3
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1.0
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1.0
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0.05
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0.005
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60-460 bp
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8%
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2.66
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1.34
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1.0
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0.05
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0.005
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50-300 bp
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10%
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2.33
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1.67
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1.0
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0.05
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0.005
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40-200 bp
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12%
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2
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2.0
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1.0
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0.05
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0.005
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25-150 bp
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15%
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0.5
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2.5
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1.0
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0.05
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0.005
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5-100 bp
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20%
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0.66
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3.34
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1.0
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0.05
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0.005
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1.1.5去(qù)除覆蓋在分(fēn)離(lí)膠上的乙醇；按照(zhào)表二将不同體(tǐ)積成分(fēn)在一個小燒杯或試管中混合；最後加入10%過硫酸铵和TEMED，輕輕攪拌使其混勻，避免産生(shēng)氣泡。
表二 TBE-PAGE 4%濃縮配方表 (總體(tǐ)積1.5 ml，适用于1mm厚度小闆膠)
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各組份體(tǐ)積（ml）
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凝膠濃度
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滅菌水
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30%PAA（29：1）
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5×TBE
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10%APS
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TEMED
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4%
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1.0
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0.2
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0.3
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0.02
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0.002
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1.1.6将濃縮膠溶液加至分(fēn)離(lí)膠的上面，直至凝膠溶液到達前玻璃闆的頂端；将梳子插入凝膠内，避免産生(shēng)氣泡。
1.1.7靜(jìng)置30-60分(fēn)鍾，等待濃縮膠聚合。
注：凝膠的聚合時間與環境溫度有關。夏天溫度較高時，聚合較快(kuài)；冬天氣溫低時，聚合時間會延長。可(kě)以根據環境溫度的不同調節APS的加入量。
1.2 電泳：
1.2.1 将凝膠闆固定在電泳裝置上，往上槽和下槽中加入1×TBE電泳液，1 ml吸頭沖洗加樣孔1-2次。
1.2.2 取待測樣品，加入相(xiàng)應體(tǐ)積6×Native PAGE DNA上樣緩沖液，如(rú)5 μl樣品加1 μl 上樣緩沖液，短(duǎn)暫離(lí)心後取5-10 μl上樣。 25bp DNA
ladder已經含有上樣緩沖液，1
mm厚10齒梳子直接上樣5
μl，其餘梳齒和厚度凝膠适量調整上樣量。
1.2.3 連接電源線，打開電源開關。200 V穩壓電泳。至二甲苯菁指示前沿到達距離(lí)凝膠下沿二分(fēn)之一位置時結束電泳（~50bp），此時溴酚藍指示前沿在凝膠下沿邊界（~17bp）。
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PAGE凝膠濃度
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恒電壓
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起始電流
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結束電流
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二甲苯菁
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溴酚藍
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電泳時間
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15%
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200 V
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25-30
mA/闆膠
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10-18 mA/闆膠
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~50 bp
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~17 bp
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35+min
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1.3染色：
1.3.1 漂洗：玻璃闆上拆下凝膠後，适量蒸餾水漂洗3-5分(fēn)鍾。
1.3.2 染色液配制：
TBE-PAGE膠可(kě)以使用RealSafe類染料後染染色，以下程序用RealSafe Red核酸染料（貨号：GR002）進行染色。即用型染色液配制：
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即用型RealSafe核酸染色液
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配制量100 ml
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1×TBE
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100 ml
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RealSafe Red核酸染料
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10 μl
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1.3.3染色和觀察：
凝膠浸泡于即用型染色液中，常溫避光(guāng)搖床40-60 rpm染色30 分(fēn)鍾。紫外光(guāng)或藍光(guāng)儀下觀察。
二、 瓊脂糖凝膠分(fēn)離(lí)：
2.1 瓊脂糖凝膠制備：
由于片段較小，建議(yì)選用高分(fēn)辨率瓊脂糖（貨号AR1036）制膠。以下步驟以制備50
ml 3%凝膠爲例：
稱取1.5
g瓊脂糖于玻璃三角瓶中，加入50
ml 1×TAE，5 μl RealSafe Red核酸染料或其他(tā)核酸染料（如(rú)EB，GoldView），混勻，蓋好瓶蓋，微波爐中火(huǒ)加熱(rè)至沸騰，輕搖混勻，重複1-2次至瓊脂糖完全溶解，無可(kě)見(jiàn)顆粒。倒入制膠容器中，插好梳子，常溫凝固30-50分(fēn)鍾至凝膠完全凝固。
2.2 電泳：
取待測樣品，加入相(xiàng)應體(tǐ)積6×DualColor DNA loading buffer，如(rú)10 μl樣品加2 μl 上樣緩沖液，短(duǎn)暫離(lí)心後取5-10 μl上樣。 25bp DNA
ladder 1 mm厚10齒梳子上樣5 μl，其餘梳齒和厚度凝膠适量調整上樣量。
建議(yì)電泳條件(jiàn)：凝膠濃度爲3％，電泳電壓8-10
v/cm（單位電壓指電泳槽陰陽極之間的距離(lí)電壓，如(rú)陰極陽極之間的距離(lí)爲20 cm，可(kě)以用160-200
V電壓進行穩壓電泳），待溴酚藍指示前沿距離(lí)凝膠末端2 cm時終止電泳，電泳時間35-40分(fēn)鍾。
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瓊脂糖濃度
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電泳緩沖液
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二甲苯菁
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溴酚藍
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單位電壓
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電泳時間
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3%
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1×TAE
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~1000 bp
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~100 bp
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8-10 V/cm
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40min+
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1×TBE
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~700 bp
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~60 bp
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8-10 V/cm
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40min+
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2.3觀察條帶。
注：使用EB或Goldview染料時，由于染料本身(shēn)帶正電荷較多，随着電泳時間的延長，染料會向陰極聚集，導緻小片段核酸結合的染料含量降低，會出現小片段的DNA片段紫外燈下亮度變弱或不可(kě)見(jiàn)。此時可(kě)以将膠浸泡于含有染料的電泳緩沖液中染色15-20分(fēn)鍾即可(kě)看(kàn)到小片段。使用RealSafe類染料可(kě)以直接觀察條帶。
2.4 實驗示例：
