單鏈DNA Marker（20-75 nt）

單鏈DNA Marker由不同長度的單鏈DNA分(fēn)子混合而成，7條帶的大(dà)小爲20，25，30，35，40， 50，75 nt。35 nt 濃度約爲100 ng/μl，其餘條帶濃度約爲50 ng/μl。該産品已經含有上樣緩沖液，使用前70度處理(lǐ)5分(fēn)鍾後可(kě)以直接上樣。該Marker适用于跑尿素變性膠，電泳後使用單鏈DNA PAGE電泳染色試劑盒（Cat：RTS5103），核酸PAGE電泳染色試劑盒（Cat：RTS5102），核酸快(kuài)速高靈敏度染色試劑盒（Cat：RTS5101）或核酸染料如(rú)RealSafe Red（貨号：GR002）或RealSafe All（貨号：GR004）均可(kě)以得(de)到清晰的條帶分(fēn)離(lí)效果。

産品内附帶2×TBE尿素上樣緩沖液（Cat：DL080-01），方便待檢樣品的上樣。以每次上樣5 μl計(jì)算，該産品可(kě)以使用大(dà)約25次。

● 保存條件(jiàn)和運輸：

-20℃貯存；有效期2年(nián)；濕冰運輸。

● 使用方法：

注：以下使用方法均以8×10cm凝膠厚1.0mm示例，其他(tā)規格凝膠請(qǐng)适當調整。

一. 凝膠制備：

1.1 可(kě)以選擇DNA尿素PAGE電泳試劑盒（Cat：RTE4102））或按照(zhào)以下程序制膠：

表一 TBE-尿素PAGE分(fēn)離(lí)膠配方表 (總體(tǐ)積5 ml，适用于厚度1.0 mm小闆膠)

單鏈DNA長度	最佳凝膠濃度	尿素（克）	40%PAA （29:1）	10×TBE	補水到總體(tǐ)積	10%APS	TEMED
200-1000 nt	5%	2.1克	0.625 ml	0.5 ml	5 ml	50 μl	5 μl
50-400 nt	8%	2.1克	1 ml	0.5 ml	5 ml	50 μl	5 μl
30-300 nt	10%	2.1克	1.25 ml	0.5 ml	5 ml	50 μl	5 μl
10-150 nt	15%	2.1克	1.875 ml	0.5 ml	5 ml	50 μl	5 μl
5-120 nt	20%	2.1克	2.5 ml	0.5 ml	5 ml	50 μl	5 μl

1.2在凝膠模具中灌入适量分(fēn)離(lí)膠溶液（對于mini-gel，凝膠液加至約距前玻璃闆頂端1.5 cm或距梳齒約0.5 cm即可(kě)），然後在分(fēn)離(lí)膠溶液上輕輕覆蓋一層1-5 cm的水層，使凝膠表面保持平整。

1.3靜(jìng)置10-20分(fēn)鍾，待分(fēn)離(lí)膠和水層之間出現一個清晰的界面後，說(shuō)明凝膠已聚合。

注：凝膠的聚合時間與環境溫度有關。夏天溫度較高時，聚合較快(kuài)；冬天氣溫低時，聚合時間會延長。可(kě)以根據環境溫度的不同調節APS的加入量。

1.4去(qù)除覆蓋在分(fēn)離(lí)膠上的水層；按照(zhào)表二将不同體(tǐ)積成分(fēn)在一個小燒杯中混合；最後加入10%過硫酸铵和TEMED，輕輕攪拌使其混勻，避免産生(shēng)氣泡。

表二 TBE-尿素PAGE 4%濃縮配方表 (總體(tǐ)積2 ml，适用于1.0mm厚度膠)

	各組份體(tǐ)積（ml）
凝膠濃度	尿素	40%PAA（29:1）	10×TBE	滅菌水	10%APS	TEMED
4%	0.84克	0.2 ml	0.2 ml	補水至體(tǐ)積2 ml	20 μl	2 μl

1.5将濃縮膠溶液加至分(fēn)離(lí)膠的上面，直至凝膠溶液到達前玻璃闆的頂端；将梳子插入凝膠内，避免産生(shēng)氣泡。

1.6靜(jìng)置30-60分(fēn)鍾，等待濃縮膠聚合。

二. 樣品制備：

2.1 取适量體(tǐ)積單鏈DNA Marker樣品（不用添加上樣緩沖液）；待測樣品與等體(tǐ)積的2×TBE尿素上樣緩沖液（Cat：DL080-01）混合，70℃處理(lǐ)5分(fēn)鍾，冰浴制冷(lěng)後待上樣。

三.電泳：

3.1. 預電泳（可(kě)選）：電泳槽内外加入适量1×TBE緩沖液穩壓200V預電泳30分(fēn)鍾。電泳結束後，用1×TBE緩沖液徹底沖洗加樣孔2-3次，去(qù)除殘餘的尿素。

3.2.上樣：根據梳齒确定Marker上樣量，一般是10齒1mm厚梳子上樣5 μl，15齒1mm厚梳子上樣3 μl。

3.3. 連接電源線，打開電源開關，按照(zhào)以下條件(jiàn)電泳。

	恒電壓	起始電流	結束電流	電泳時間	适用條件(jiàn)
推薦電壓	200 V	15-20 mA/闆膠	10-15 mA/闆膠	60+ min	最佳電壓，最優的分(fēn)辨率

3.4. 等待上樣緩沖液的溴酚藍指示前沿到凝膠底部時終止電泳，取出凝膠進行後續實驗。

變性膠濃度	溴酚藍	二甲苯菁
5%	35 nt	130 nt
8%	19 nt	75 nt
10%	15 nt	55 nt
15%	10 nt	52 nt
20%	8 nt	35 nt

四．染色：

用單鏈DNA PAGE電泳染色試劑盒（Cat：RTS5103），核酸PAGE電泳染色試劑盒（Cat：RTS5102）或核酸快(kuài)速高靈敏度染色試劑盒（Cat：RTS5101）染色均可(kě)以得(de)到清晰的條帶分(fēn)離(lí)效果。注：如(rú)果使用核酸染料染色，RealSafe Red（貨号：GR002）或RealSafe All（貨号：GR004）核酸染料結合單鏈核酸效果最佳，強烈建議(yì)使用以便獲得(de)最佳效果的膠圖。其餘染料如(rú)GelRed，Goldview，EB等染色效果不好。

● 注意事(shì)項：

1. 單鏈DNA Marker産品适用于變性PAGE垂直電泳，不适用于水平瓊脂糖凝膠電泳。

● 電泳示例：

1. 使用單鏈DNA PAGE電泳染色試劑盒（貨号：RTS5103）染色：