10bp 雙鏈RNA ladder
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貨号
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名稱
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規格
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RTM504
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10bp 雙鏈RNA ladder
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25次
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● 産品組成：
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貨号
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名稱
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規格
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RTM504-01
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10bp dsRNA ladder
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100 μl
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RTM504-02
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5×RNA上樣緩沖液
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1 ml
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● 産品簡介：
10bp
dsRNA ladder由長度20
bp至1,000
bp的10條dsRNA（雙鏈RNA）片段組成，片段大(dà)小爲20，30，40，50，100，200，300，400，500，1000 bp，其中100 bp的雙鏈 RNA片段爲增強帶，顯示亮帶，可(kě)作(zuò)爲參照(zhào)。
本産品爲雙鏈RNA
Marker，适用于非變性的PAGE電泳，不适用于變性PAGE電泳（尿素），也不建議(yì)用于瓊脂糖電泳。可(kě)以用于制備siRNA（小幹擾RNA，Small interfering RNA）時标記雙鏈RNA片段大(dà)小。
按照(zhào)每次上樣5
μl計(jì)算，該産品配制好即用型産品可(kě)以使用約25次。
注意：
1.由于RNA極易污染後降解，實驗操作(zuò)時采取必要措施防止RNase污染，如(rú)佩戴一次性手套，使用專用RNase-free吸頭及離(lí)心管等；不要在同一區域進行涉及RNase的實驗，如(rú)質粒提取等。
2.由于dsRNA序列不同，顯示的片段長度會略有不同；使用的siRNA片段中含有DNA片段時，片段大(dà)小會略有差異。
● 儲存條件(jiàn)：
-20℃ 貯存，有效期一年(nián)。
● 使用方法：
一、即用型10bp dsRNA ladder配制方法：
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即用型10bp dsRNA ladder配制量
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5 μl
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10 μl
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15 μl
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20 μl
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10bp
dsRNA ladder
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4 μl
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8 μl
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12 μl
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16 μl
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5×RNA上樣緩沖液
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1 μl
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2 μl
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3 μl
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4 μl
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注：即用型dsRNA Marker建議(yì)現用現配，不建議(yì)配制後保存，保存後會導緻電泳後條帶模糊。
二、 TBE-PAGE凝膠制備：
2.1 制備凝膠步驟：
2.1.1參照(zhào)凝膠模具說(shuō)明書(shū)，裝配好凝膠模具。
2.1.2按照(zhào)表一将不同體(tǐ)積的成分(fēn)在小燒杯或試管中混合；最後加入10%APS和TEMED，輕輕攪拌使其混勻，避免産生(shēng)氣泡。
注：10 bp dsRNA ladder 适用于配制15%TBE-PAGE膠。
2.1.3在凝膠模具中灌入适量分(fēn)離(lí)膠溶液（對于mini-gel，凝膠液加至約距前玻璃闆頂端1.5 cm或距梳齒約0.5 cm即可(kě)），然後在分(fēn)離(lí)膠溶液上輕輕覆蓋一層1-2 cm的無水乙醇，使凝膠表面保持平整。
2.1.4靜(jìng)置10-20分(fēn)鍾，待分(fēn)離(lí)膠和乙醇層之間出現一個清晰的界面後，說(shuō)明凝膠已聚合。
表一 TBE-PAGE分(fēn)離(lí)膠配方表 (總體(tǐ)積5 ml，适用于1mm厚度小闆膠)
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各組份體(tǐ)積（ml）
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最佳dsRNA分(fēn)離(lí)範圍
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凝膠濃度
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滅菌水
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30%PAA(29:1)
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5×TBE
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10%APS
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TEMED
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70-450 bp
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6%
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3
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1.0
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1
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0.05
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0.005
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60-460 bp
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8%
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2.66
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1.34
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1
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0.05
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0.005
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50-300 bp
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10%
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2.33
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1.67
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1
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0.05
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0.005
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40-200 bp
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12%
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2
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2.0
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1
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0.05
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0.005
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25-150 bp
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15%
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1.5
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2.5
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1
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0.05
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0.005
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5-100 bp
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20%
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0.66
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3.34
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1
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0.05
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0.005
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2.1.5去(qù)除覆蓋在分(fēn)離(lí)膠上的乙醇；按照(zhào)表二将不同體(tǐ)積成分(fēn)在一個小燒杯或試管中混合；最後加入10%過硫酸铵和TEMED，輕輕攪拌使其混勻，避免産生(shēng)氣泡。
表二 TBE-PAGE 4%濃縮配方表 (總體(tǐ)積1.5 ml，适用于1mm厚度小闆膠)
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各組份體(tǐ)積（ml） 總體(tǐ)積1.5 ml
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凝膠濃度
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滅菌水
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30%PAA(29:1)
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5×TBE
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10%APS
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TEMED
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4%
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1
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0.2
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0.3
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0.02
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0.002
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2.1.6将濃縮膠溶液加至分(fēn)離(lí)膠的上面，直至凝膠溶液到達前玻璃闆的頂端；将梳子插入凝膠内，避免産生(shēng)氣泡。
2.1.7靜(jìng)置30-60分(fēn)鍾，等待濃縮膠聚合。
注：凝膠的聚合時間與環境溫度有關。夏天溫度較高時，聚合較快(kuài)；冬天氣溫低時，聚合時間會延長。可(kě)以根據環境溫度的不同調節APS的加入量。
2.2電泳：
2.2.1 将凝膠闆固定在電泳裝置上，往上槽和下槽中加入1×TBE電泳液，1 ml吸頭沖洗加樣孔1-2次。
2.2.2 取待測樣品，加入相(xiàng)應體(tǐ)積5×RNA上樣緩沖液，如(rú)8 μl樣品加2 μl 上樣緩沖液，短(duǎn)暫離(lí)心後取5-10 μl上樣。 即用型10 bp dsRNA ladder 1 mm厚10齒梳子上樣5 μl，其餘梳齒和厚度凝膠适量調整上樣量。
2.2.3 連接電源線，打開電源開關。150 V穩壓電泳，至溴酚藍指示前沿距離(lí)玻璃下沿2 cm時結束電泳（參見(jiàn)下圖）。
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TBE-PAGE電泳
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恒電壓
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起始電流
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結束電流
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電泳時間
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150 V
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15-25
mA/闆膠
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8-15 mA/闆膠
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50+min
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15%T3.3C TBE-PAGE
溴酚藍前沿大(dà)小約15bp dsRNA，二甲苯菁大(dà)小約60bp dsRNA。
3、染色：
3.3.1 漂洗：玻璃闆上拆下凝膠後，适量蒸餾水漂洗3-5分(fēn)鍾。
3.3.2 染色液配制：
TBE-PAGE膠可(kě)以使用EB或RealSafe核酸染料後染染色，以下程序用RealSafe Red核酸染料（貨号：GR002）進行染色。即用型染色液配制：
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即用型RealSafe核酸染色液
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100 ml
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1×TBE
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100 ml
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RealSafe Red核酸染料
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20 μl
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3.3.3染色和觀察：
凝膠浸泡于即用型染色液中，常溫避光(guāng)搖床40-60 rpm染色30 分(fēn)鍾。紫外光(guāng)下觀察。
三、實驗示例：
15％TBE-PAGE電泳
左1：10bp DNA ladder（貨号：RTM443） 5μl
左2：20bp DNA ladder（貨号：RTM441） 5μl
左3：即用型10 bp dsRNA ladder 5μl
（4 μl 10 bp dsRNA ladder加1 μl 5×RNA上樣緩沖液）
凝膠長度：8 cm
電泳條件(jiàn)：穩壓150 V 起始電流20 mA，終止電流10 mA
電泳緩沖液：1×TBE
電泳時間：50分(fēn)鍾
染色：RealSafe Red核酸染料後染30分(fēn)鍾