單鏈RNA Marker(15-50 nt)
● 産品編号及規格:
貨号
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名稱
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規格
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貯存
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RTM505-01
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單鏈RNA Marker(15-50 nt)
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60 μl
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-20℃
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RTM505-02
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2×RNA上樣緩沖液 (尿素變性膠,RNase-free)
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1 ml
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-20℃
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● 産品簡介:
單鏈RNA Marker由不同長度的單鏈RNA分(fēn)子混合而成,5條帶的大(dà)小爲15,20,25,30, 40,50
nt。樣品保存在 TE緩沖液中,每條帶濃度約爲100 ng/μl(配成即用型RNA Marker後,每條帶的濃度約爲50
ng/μl)。使用前與等體(tǐ)積2×RNA上樣緩沖液混合即可(kě)上樣電泳。該Marker适用于跑尿素變性膠,電泳後可(kě)以使用核酸染料如(rú)RealSafe
Red(貨号:GR002)或RealSafe
All(貨号:GR004)均可(kě)以染色得(de)到清晰的條帶分(fēn)離(lí)效果。
産品内附帶2×RNA上樣緩沖液 (尿素變性膠,RNase-free)。以每次上樣5
μl計(jì)算,混合好的單鏈RNA
Marker可(kě)以使用大(dà)約25次。
● 保存條件(jiàn)和運輸:
-20℃貯存,有效期24個月;濕冰運輸。
● 使用方法:
注:以下使用方法均以8×10cm凝膠 厚1.0mm示例,其他(tā)規格凝膠請(qǐng)适當調整。
一. 凝膠制備:
1.1 可(kě)以選擇RNA尿素PAGE電泳試劑盒(Cat:RTE4103))或按照(zhào)以下程序制膠。
1.2.分(fēn)離(lí)膠配制:根據表格一,将不同體(tǐ)積的成分(fēn)混合,漩渦攪拌至尿素徹底溶解。
表一 TBE-尿素PAGE分(fēn)離(lí)膠配方表 (總體(tǐ)積5 ml,适用于厚度1.0 mm小闆膠)
RNA長度
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最佳凝膠濃度
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尿素(克)
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40%PAA
(29:1)
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10×TBE
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RNase-free水
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10%APS
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TEMED
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200-1000 nt
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5%
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2.1克
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0.625 ml
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0.5 ml
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至體(tǐ)積5 ml
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50 μl
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5 μl
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50-400 nt
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8%
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2.1克
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1 ml
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0.5 ml
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至體(tǐ)積5 ml
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50 μl
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5 μl
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30-300 nt
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10%
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2.1克
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1.25 ml
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0.5 ml
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至體(tǐ)積5 ml
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50 μl
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5 μl
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40-200 nt
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12%
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2.1克
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1.5 ml
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0.5 ml
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至體(tǐ)積5 ml
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50 μl
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5 μl
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10-150 nt
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15%
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2.1克
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1.875 ml
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0.5 ml
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至體(tǐ)積5 ml
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50 μl
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5 μl
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6-100 nt
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20%
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2.1克
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2.5 ml
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0.5 ml
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至體(tǐ)積5 ml
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50 μl
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5 μl
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1.3在凝膠模具中灌入适量分(fēn)離(lí)膠溶液(對于mini-gel,凝膠液加至約距前玻璃闆頂端1.5 cm或距梳齒約0.5 cm即可(kě)),然後在分(fēn)離(lí)膠溶液上輕輕覆蓋一層1-5 cm的水層,使凝膠表面保持平整。
1.4靜(jìng)置10-20分(fēn)鍾,待分(fēn)離(lí)膠和水層之間出現一個清晰的界面後,說(shuō)明凝膠已聚合。
注:凝膠的聚合時間與環境溫度有關。夏天溫度較高時,聚合較快(kuài);冬天氣溫低時,聚合時間會延長。可(kě)以根據環境溫度的不同調節APS的加入量。
1.5去(qù)除覆蓋在分(fēn)離(lí)膠上的水層;按照(zhào)表二将不同體(tǐ)積成分(fēn)在一個小燒杯中混合;最後加入10%過硫酸铵和TEMED,輕輕攪拌使其混勻,避免産生(shēng)氣泡。
表二 TBE-尿素PAGE 4%濃縮配方表 (總體(tǐ)積2 ml,适用于1.0mm厚度膠)
各組份體(tǐ)積(ml)
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尿素
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40%PAA(29:1)
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10×TBE
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RNase-free水
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10%APS
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TEMED
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0.84克
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0.2 ml
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0.2 ml
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補至體(tǐ)積2 ml
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20 μl
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2 μl
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1.6将濃縮膠溶液加至分(fēn)離(lí)膠的上面,直至凝膠溶液到達前玻璃闆的頂端;将梳子插入凝膠内,避免産生(shēng)氣泡。
1.7常溫靜(jìng)置30-60分(fēn)鍾,等待濃縮膠聚合。
注:凝膠的聚合時間與環境溫度有關。夏天溫度較高時,聚合較快(kuài);冬天氣溫低時,聚合時間會延長。可(kě)以根據環境溫度的不同調節APS的加入量。
二. 樣品制備:
2.1
取适量體(tǐ)積單鏈RNA
Marker樣品與等體(tǐ)積的2×RNA上樣緩沖液 (尿素變性膠,RNase-free)混合,70℃處理(lǐ)5分(fēn)鍾,冰浴制冷(lěng)後待上樣。待測樣品也需要進行同樣處理(lǐ)。
三.電泳:
3.1. 預電泳(可(kě)選):電泳槽内外加入适量1×TBE緩沖液穩壓200V預電泳30分(fēn)鍾。電泳結束後,用1×TBE緩沖液徹底沖洗加樣孔2-3次,去(qù)除殘餘的尿素。
3.2.上樣:根據梳齒确定Marker上樣量, 一般是10齒1mm厚梳子Marker上樣5 μl,15齒1mm厚梳子上樣3 μl。
3.3. 連接電源線,打開電源開關,按照(zhào)以下條件(jiàn)電泳。
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恒電壓
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起始電流
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結束電流
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電泳時間
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适用條件(jiàn)
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推薦電壓
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200V
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15-20 mA/闆膠
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10-15 mA/闆膠
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60+ min
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最佳電壓,最優的分(fēn)辨率
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3.4. 等待上樣緩沖液的溴酚藍指示前沿到凝膠底部時終止電泳,取出凝膠進行後續實驗。
變性膠濃度
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溴酚藍
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二甲苯菁
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5%
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35 nt
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130 nt
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8%
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19 nt
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75 nt
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10%
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15 nt
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55 nt
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15%
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10 nt
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52 nt
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20%
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5 nt
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35 nt
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四.染色:
單鏈RNA推薦用RealSafe Red(貨号:GR002)或RealSafe
All(貨号:GR004)染色,兩種染料均可(kě)以得(de)到清晰的條帶分(fēn)離(lí)效果。
注:其餘染料如(rú)GelRed,Goldview,EB等染色效果不好。
● 注意事(shì)項:
1. 單鏈RNA Marker産品适用于變性PAGE垂直電泳,不适用于水平瓊脂糖凝膠電泳。
2. 建議(yì)單鏈RNA Marker現用現配,因爲混合有上樣緩沖液的單鏈RNA穩定性不好。
3. ssRNA實驗樣品序列和實驗樣品上樣量的不同,顯示的片段大(dà)小與Marker可(kě)能會有微弱的差别。
● 電泳示例:
1. 使用RealSafe Red核酸染料(貨号:GR002)染色:
2. 使用核酸快(kuài)速高靈敏度染色試劑盒(貨号:RTS5101)染色: