單鏈DNA Marker（15-120 nt）
|
貨号
|
名稱
|
規格
|
|
RTM506
|
單鏈DNA Marker（15-120 nt）
|
10次
|
● 産品組成：
|
貨号
|
名稱
|
規格
|
貯存
|
|
RTM506-01
|
單鏈DNA Marker（15-120 nt）
|
50 μl
|
-20℃
|
|
DL080-01
|
2×TBE尿素上樣緩沖液
|
1 ml
|
-20℃
|
● 産品簡介：
單鏈DNA Marker由6條不同長度的單鏈DNA分(fēn)子混合而成，6條帶的大(dà)小爲15，40，60，80，100，120 nt，80 nt 濃度爲0.4 μg/μl，其餘條帶濃度爲0.2
μg/μl。該Marker适用于跑尿素變性膠，電泳後使用單鏈DNA
PAGE電泳染色試劑盒（Cat：RTS5103），核酸PAGE電泳染色試劑盒（Cat：RTS5102），核酸快(kuài)速高靈敏度染色試劑盒（Cat：RTS5101）或RealSafe類核酸染料染色均可(kě)以得(de)到清晰的條帶分(fēn)離(lí)效果。
樣品保存在1×TBE尿素上樣緩沖液中，上樣方便。以每次上樣5 μl計(jì)算，該單鏈DNA
Marker可(kě)以使用大(dà)約10次。
● 保存條件(jiàn)和運輸：
-20℃貯存，有效期24個月；濕冰運輸。
● 使用方法：
注：以下使用方法均以8×10cm凝膠 厚1.0mm示例，其他(tā)規格凝膠請(qǐng)适當調整。
一. 凝膠制備：
1.1 可(kě)以選擇DNA尿素PAGE電泳試劑盒（Cat：RTE4102））或按照(zhào)以下程序制膠：
表一 TBE-尿素PAGE分(fēn)離(lí)膠配方表 (總體(tǐ)積5 ml，适用于厚度1.0 mm小闆膠)
|
單鏈DNA長度
|
最佳凝膠濃度
|
尿素（克）
|
40%PAA
（29:1）
|
5×TBE
|
補水到總體(tǐ)積
|
10%APS
|
TEMED
|
|
200-1000 nt
|
5%
|
2.1克
|
0.625 ml
|
1 ml
|
5 ml
|
50 μl
|
5 μl
|
|
50-400 nt
|
8%
|
2.1克
|
1 ml
|
1 ml
|
5 ml
|
50 μl
|
5 μl
|
|
30-300 nt
|
10%
|
2.1克
|
1.25 ml
|
1 ml
|
5 ml
|
50 μl
|
5 μl
|
|
10-150 nt
|
15%
|
2.1克
|
1.875 ml
|
1 ml
|
5 ml
|
50 μl
|
5 μl
|
最後加入10%APS和TEMD後，立即混勻。
1.2在凝膠模具中灌入适量分(fēn)離(lí)膠溶液（對于mini-gel，凝膠液加至約距前玻璃闆頂端1.5 cm或距梳齒約0.5 cm即可(kě)），然後在分(fēn)離(lí)膠溶液上輕輕覆蓋一層1-5 cm的水層，使凝膠表面保持平整。
1.3靜(jìng)置10-20分(fēn)鍾，待分(fēn)離(lí)膠和水層之間出現一個清晰的界面後，說(shuō)明凝膠已聚合。
注：凝膠的聚合時間與環境溫度有關。夏天溫度較高時，聚合較快(kuài)；冬天氣溫低時，聚合時間會延長。可(kě)以根據環境溫度的不同調節APS的加入量。
1.4去(qù)除覆蓋在分(fēn)離(lí)膠上的水層；按照(zhào)表二将不同體(tǐ)積成分(fēn)在一個小燒杯中混合；最後加入10%過硫酸铵和TEMED，輕輕攪拌使其混勻，避免産生(shēng)氣泡。
表二 TBE-尿素PAGE 4%濃縮配方表 (總體(tǐ)積2 ml，适用于1.0mm厚度膠)
|
|
各組份體(tǐ)積（ml）
|
|
凝膠濃度
|
尿素
|
40%PAA（29:1）
|
5×TBE
|
滅菌水
|
10%APS
|
TEMED
|
|
4%
|
0.84克
|
0.2 ml
|
0.4 ml
|
補水至體(tǐ)積2 ml
|
20 μl
|
2 μl
|
1.5将濃縮膠溶液加至分(fēn)離(lí)膠的上面，直至凝膠溶液到達前玻璃闆的頂端；将梳子插入凝膠内，避免産生(shēng)氣泡。
1.6靜(jìng)置30-60分(fēn)鍾，等待濃縮膠聚合。
注：凝膠的聚合時間與環境溫度有關。夏天溫度較高時，聚合較快(kuài)；冬天氣溫低時，聚合時間會延長。可(kě)以根據環境溫度的不同調節APS的加入量。
二. 樣品制備：
2.1
取适量體(tǐ)積單鏈DNA
Marker樣品，70℃處理(lǐ)5分(fēn)鍾，冰浴制冷(lěng)後待上樣；待測樣品序與2×TBE尿素上樣緩沖液等體(tǐ)積混合後70℃處理(lǐ)5分(fēn)鍾，冰浴制冷(lěng)後待上樣。
三.電泳：
3.1. 預電泳（可(kě)選）：電泳槽内外加入适量1×TBE緩沖液穩壓200 V預電泳30分(fēn)鍾。電泳結束後，用1×TBE緩沖液徹底沖洗加樣孔2-3次，去(qù)除殘餘的尿素。
3.2.上樣：根據梳齒确定Marker上樣量， 一般是10齒1mm厚梳子上樣5
μl，15齒1mm厚梳子上樣3
μl。
3.3. 連接電源線，打開電源開關，按照(zhào)以下條件(jiàn)電泳。
|
|
恒電壓
|
起始電流
|
結束電流
|
電泳時間
|
适用條件(jiàn)
|
|
推薦電壓
|
200V
|
15-20 mA/闆膠
|
10-15 mA/闆膠
|
60+ min
|
最佳電壓，最優的分(fēn)辨率
|
3.4. 等待上樣緩沖液的溴酚藍指示前沿到凝膠底部時終止電泳，取出凝膠進行後續實驗。
|
變性膠濃度
|
溴酚藍
|
二甲苯菁
|
|
5%
|
35 nt
|
130 nt
|
|
8%
|
19 nt
|
75 nt
|
|
10%
|
15 nt
|
55 nt
|
|
15%
|
8 nt
|
42 nt
|
四．染色：
用單鏈DNA PAGE電泳染色試劑盒（Cat：RTS5103），核酸PAGE電泳染色試劑盒（Cat：RTS5102）或核酸快(kuài)速銀染試劑盒（Cat：RTS5101）染色均可(kě)以得(de)到清晰的條帶分(fēn)離(lí)效果。
注：如(rú)果使用核酸染料染色，RealSafe
Red（貨号：GR002）或RealSafe
All（貨号：GR004）核酸染料結合單鏈核酸效果最佳，強烈建議(yì)使用以便獲得(de)最佳效果的膠圖。其餘染料如(rú)GelRed，Goldview，EB等染色效果不好。
● 電泳示例：
1. 使用RealSafe Red核酸染料（貨号：GR002）染色：
2. 使用核酸快(kuài)速高靈敏度染色試劑盒（貨号：RTS5101）染色：
