2×SYBR qPCR MasterMix（Universal）
● 産品包裝：
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組成
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RTQ3101-02
(可(kě)做40次50 μl反應)
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RTQ3101-03
(可(kě)做200次50 μl反應)
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RTQ3101-04
(可(kě)做1000次50 μl反應)
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長期貯存
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2×SYBR qPCR MasterMix
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1ml
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5×1ml
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25×1ml
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-20℃
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RNase-free water
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1 ml
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5×1 ml
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25×1 ml
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-20℃
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注：以50μl qPCR反應體(tǐ)系爲例，每次使用25 μl 2×MasterMix，1 ml可(kě)做40次 50μl qPCR反應。
● 儲存條件(jiàn): -20℃避光(guāng)保存；經常使用時，一旦融化後請(qǐng)4℃貯存，4℃保存至少3個月；盡量避免反複凍融。
● 産品簡介：
本制品是采用SYBR® Green I嵌合熒光(guāng)法進行Real Time PCR的專用試劑。已經将 Hot-Start DNA聚合酶、dNTP、特殊穩定劑、優化的反應緩沖液和 SYBR® Green I 等試劑預混成一種适合 Real Time PCR反應檢測用 2×MasterMix試劑，具有靈敏度高、特異性強、穩定性好等特點。
本制品使用新型抗體(tǐ)修飾的 HotStart Taq DNA聚合酶，并結合精心優化的反應 Buffer，從(cóng)而有效抑制低溫下的非特異性擴增，提高反應特異性和擴增效率，能夠在更寬廣的範圍内進行準确定量。使用時隻需加入模闆、引物和水，便可(kě)在寬廣的定量區域内得(de)到良好的标準曲線，對目的基因進行準确定量檢測，重複性好，可(kě)信度高。
預混液中含有優化的校(xiào)正染料，與一系列qPCR設備兼容，包括需要ROX校(xiào)正的儀器，實驗操作(zuò)過程中不需要額外添加校(xiào)準染料來(lái)校(xiào)正儀器。
● 注意事(shì)項
1. 本制品中已經含有優化的校(xiào)正染料，客戶無需再添加校(xiào)正染料，可(kě)以直接使用。
2. 本制品含SYBR® Green I，強光(guāng)下易分(fēn)解，使用時避免長時間強光(guāng)照(zhào)射本制品。
3. 建議(yì)在冰上配制qPCR反應液，再放(fàng)入qPCR儀器中擴增。可(kě)以提高擴增特異性，減少背景。
4.-20℃下保存時間較長，有微量沉澱産生(shēng)，充分(fēn)混勻後不影(yǐng)響使用。本制品已經優化了反應緩沖液中的Mg2+濃度，無需再調節Mg2+濃度。
5. 模闆DNA：用本産品，cDNA、基因組DNA、質粒DNA、病毒DNA等都(dōu)可(kě)作(zuò)爲模闆。在添加DNA模闆時請(qǐng)注意模闆量對PCR擴增的影(yǐng)響。本産品建議(yì)添加量爲：cDNA添加量不應超過總反應體(tǐ)系的10%；基因組DNA爲模闆時，爲避免在高濃度區域出現線性差的情況，請(qǐng)注意添加量小于500 ng；病毒DNA也可(kě)作(zuò)爲PCR模闆，添加時請(qǐng)以300 ng爲上限；由于質粒DNA濃度和拷貝數很高，在添加PCR模闆之前最好進行稀釋梯度試驗，以便确定合适的質粒DNA拷貝數。
6. 引物：
建議(yì)每條引物工(gōng)作(zuò)濃度200 nM-800 nM；爲得(de)到高靈敏度定量性的數據，引物的設計(jì)非常重要。以下列舉了設計(jì)引物時需注意的一般事(shì)項。
a) 引物長度請(qǐng)設定爲18bp～30bp、GC含量爲40%～65%；
b) 擴增片段一般小于300bp，請(qǐng)盡量設定在80bp～150bp。過長的片段容易導緻擴增效率降低；
c) 如(rú)設計(jì)mRNA爲目的片段的引物，設計(jì)應盡量橫跨内含子，以防止基因組DNA的擴增而引起假陽性；
d) 請(qǐng)盡量選擇Tm爲65℃～67℃；
e) A、G、C、T整體(tǐ)分(fēn)布盡量均勻。不要有部分(fēn)的GC rich或AT rich（特别是3'端）。避開T/C（Polypyrimidine）或A/G（Polypurine）的連續結構；
f) 避開引物内部或兩條引物之間有3個堿基以上的互補序列。二條引物間的3'末端避開有2個堿基以上的互補序列；
g) 引物設計(jì)完成後要使用BLAST檢索确認引物的特異性。
此外，引物的純化純度對反應特異性有很大(dà)的影(yǐng)響。經過一般純化、純度較低的引物熒光(guāng)強度散亂，容易産生(shēng)非特異性産物，緻使熔解曲線出現雜峰。請(qǐng)盡可(kě)能使用HPLC級别純化，至少要用經Cartridge(OPC)級别以上純化的引物。
7. 對照(zhào)設計(jì)：
1）No template control（NTC）：在qPCR反應體(tǐ)系中僅僅缺少模闆。用以檢測有無二聚體(tǐ)和試劑有無污染。
2）Reverse Transcripase control：用以評估逆轉錄反應中有無基因組DNA的污染。在逆轉錄反應中僅僅不含有逆轉錄酶。
● 使用說(shuō)明：
1. 冰浴中徹底融化2×qMasterMix，避免渦旋震蕩，以免産生(shēng)過多氣泡，徹底混勻後快(kuài)甩離(lí)心将溶液收集到管底。
2. 按照(zhào)下表在制備反應體(tǐ)系：
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50 μl反應體(tǐ)系
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20 μl反應體(tǐ)系
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終濃度
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2×qPCR MasterMix
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25 μl
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10 μl
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1×
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上遊引物 10 μM
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1 μl
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0.4 μl
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0.2 μM
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下遊引物 10 μM
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1 μl
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0.4 μl
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0.2 μM
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模闆
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× μl
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x μl
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10pg-100ng
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水
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補至50 μl
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補至20 μl
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3. 快(kuài)甩離(lí)心将反應液收集到管底。
4. 檢測片段大(dà)于300 bp，qPCR儀上推薦執行以下程序（三步法）：
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步驟
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溫度
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時間
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循環數
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初始變性
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95℃
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30 sec*
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1
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變性
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95℃
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15 sec
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40
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退火(huǒ)
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55-65℃
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30 sec
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延伸
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72℃
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30 sec
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熔解曲線
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使用機(jī)器默認采集程序
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檢測片段小于300 bp，qPCR儀上推薦執行以下程序（兩步法）：
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步驟
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溫度
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時間
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循環數
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初始變性
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95℃
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30 sec*
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1
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變性
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95℃
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15 sec
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40
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退火(huǒ)和延伸
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60℃
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60 sec
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熔解曲線
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使用機(jī)器默認采集程序
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注：由于本MasterMix中的Hot-start DNA聚合酶是經過抗體(tǐ)修飾的，初始變性95℃30 sec即可(kě)。
● 實驗結果分(fēn)析
反應結束後加做融解曲線，以區分(fēn)擴增産物及引物二聚體(tǐ)。根據擴增曲線和融解解曲線結果可(kě)進行PCR定量标準曲線的制作(zuò)。
● 常見(jiàn)問(wèn)題及處理(lǐ)
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問(wèn)題
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可(kě)能原因
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推薦的解決方法
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無擴增曲線且無擴增産物（凝膠電泳）
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反應體(tǐ)系中有PCR反應抑制劑
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更換或純化模闆DNA。
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引物設計(jì)不合理(lǐ)
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重新設計(jì)、合成引物。
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逆轉錄産物體(tǐ)積過量
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減少逆轉錄産物量以不超過反應體(tǐ)系的10%。
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加樣錯誤或有試劑未加
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檢查是否加了所有的所需試劑。
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引物的降解
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通過PAGE電泳檢測引物完整性。
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退火(huǒ)溫度不正确
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優化退火(huǒ)溫度。
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無擴增曲線但(dàn)有擴增産物（凝膠電泳）
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qPCR儀設置不正确
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檢查dye selction，reference dye是否選擇正确
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失效的熒光(guāng)檢測
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熒光(guāng)檢測應在PCR循環的退火(huǒ)/延伸階段。
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熒光(guāng)PCR儀問(wèn)題
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參考qPCR儀器說(shuō)明書(shū)
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陰性對照(zhào)（NTC）有擴增曲線
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反應體(tǐ)系中有污染
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qPCR片段較小，極易造成環境中氣溶膠污染。如(rú)果融解曲線分(fēn)析，解鏈溫度和目的片段相(xiàng)同，凝膠電泳中NTC中的片段大(dà)小和目的片段相(xiàng)同，極有可(kě)能是反應體(tǐ)系中某一或某些試劑污染所引起的。建議(yì)換至沒有污染源的環境進行PCR體(tǐ)系的配制。
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引物二聚體(tǐ)
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進行溶解曲線分(fēn)析，如(rú)果擴增曲線的解鏈溫度小于80℃，凝膠電泳片段大(dà)小和目的片度不符。請(qǐng)重新設計(jì)引物。
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提高退火(huǒ)溫度3℃。
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PCR效率高于110%
(斜率>-3.1）
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有非特異性擴增
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溶解曲線分(fēn)析非特異性擴增；優化引物設計(jì)
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PCR擴增效率低于90%
(斜率<-3.6)
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反應體(tǐ)系中有PCR反應抑制劑
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更換或純化模闆DNA
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PCR擴增條件(jiàn)不合适引起擴增效率降低。
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确認引物濃度。注意qPCR Master Mix是否失效。
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引物設計(jì)
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重新設計(jì)引物，避免擴增區域的DNA二級結構。
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實時熒光(guāng)曲線線性不好
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模闆DNA含量較低或過高
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應調整樣品的DNA濃度。
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模闆DNA中含有抑制PCR擴增反應的物質
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對模闆DNA進行純化或更換模闆。
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質量不好的逆轉錄試劑盒合成的cDNA，逆轉錄反應液中所含的物質可(kě)能抑制PCR反應。
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請(qǐng)降低樣品濃度，或将樣品純化後再進行反應。建議(yì)使用品牌質量較好的cDNA合成逆轉錄試劑盒。
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CT值高于預期值
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加入的模闆量太少
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适當增加模闆量。
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樣品被降解
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檢查樣品的完整性。
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引物不合适
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重新設計(jì)合成引物。
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CT值低于預期值
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加入了過多的模闆
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減少模闆量。
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PCR産物太長
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一般采用100-150bp的産物長度，一般不超過500bp
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CT值的标準差>0.16
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取樣不準确
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每種樣品的反應混合液單獨配制，充分(fēn)混勻；
qPCR之前要離(lí)心，管壁不要沾有反應液。
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ΔRn值太小
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PCR效率太低
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優化PCR反應條件(jiàn)。
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目标模闆數太低
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增加模闆量。
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擴增曲線的熒光(guāng)信号弱，或擴增曲線呈鋸齒狀
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PCR的延伸時間過短(duǎn)即熒光(guāng)讀(dú)取時間不充分(fēn)，熒光(guāng)收集不能充分(fēn)完成。
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适當增加延伸時間。
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以少于PCR儀器标準條件(jiàn)的反應體(tǐ)積進行擴增，熒光(guāng)收集量的誤差會增大(dà)
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應增加反應體(tǐ)積以滿足PCR儀器标準。
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