RNA提取試劑（目錄号：RTR2301）

● 試劑内容：

● 儲存、運輸及效期：

2-8℃避光(guāng)保存；常溫運輸；有效期1年(nián)。

● 産品簡介：

RNA提取試劑是從(cóng)細胞和組織中提取總RNA的即用型試劑，可(kě)以提取細菌、植物、動物組織和細胞以及新鮮血液的總RNA。提取的總RNA可(kě)用于Northern blot、RT-PCR、Dot blot、RNase保護分(fēn)析等分(fēn)子生(shēng)物學實驗。

● 産品特點：

1 分(fēn)相(xiàng)明顯：本試劑爲粉紅(hóng)色，便于氯仿分(fēn)相(xiàng)後區分(fēn)水相(xiàng)和有機(jī)相(xiàng)。

2 結果可(kě)靠：該試劑含有強烈抑制RNase活性的物質，可(kě)靠保護RNA不降解。

3 價廉物美：其提取效果與國(guó)外進口産品相(xiàng)媲美，價格卻低于它的三分(fēn)之一。

● 操作(zuò)步驟：

實驗前需要準備的試劑和耗材：

氯仿、異丙醇、75%乙醇（用RNase-free水配制）、RNase-free的水、RNase-free的耗材（Tip頭，離(lí)心管等）。

1. 勻漿處理(lǐ)（Homogenization）

1.1組織中提取總RNA：

1.1.1植物組織：植物葉片直接放(fàng)入研缽中，加入少量液氮，迅速研磨成粉末，每50-100mg植物葉片加入1ml RNA提取試劑。

1.1.2動物組織：按10-30mg組織加入1ml RNA提取試劑，用電動勻漿器或者一次性研磨杵充分(fēn)勻漿。

1.2 培養細胞中提取總RNA：

1.2.1貼壁細胞：無須胰酶消化，可(kě)直接用RNA提取試劑進行裂解，每10cm²培養面積加1ml RNA提取試劑。

1.2.2懸浮細胞：可(kě)直接離(lí)心收集、裂解，每1ml RNA提取試劑可(kě)裂解5×10⁶動物或酵母細胞，或10⁷細菌細胞。

1.3 血液中提取總RNA：

直接取新鮮的血液，加入3倍體(tǐ)積紅(hóng)細胞裂解液，混勻後常溫放(fàng)置10分(fēn)鍾，9,000 g離(lí)心1分(fēn)鍾。徹底吸棄上清，收集白(bái)細胞沉澱。每100-200μl血液收集的白(bái)細胞沉澱加入1ml RNA提取試劑。

2．分(fēn)層（Phase Separation）

根據樣品，選擇使用方法2.1或者方法 2.2。如(rú)果不确定，則使用方法2.2。

2.1  (細胞，血液，一般動物組織) – 常溫靜(jìng)置 5 分(fēn)鍾，再按照(zhào) 1 ml RNA提取試劑 使用 200 μl 的比例加入氯仿，用力颠倒離(lí)心管以混勻；常溫靜(jìng)置 3 -5 分(fēn)鍾使之分(fēn)層後，4℃12,000g離(lí)心 15 分(fēn)鍾。

2.2  (植物，脂肪及肝髒等某些雜質含量較高的樣品) – 常溫靜(jìng)置 5 分(fēn)鍾後，4℃12,000 g離(lí)心 10 分(fēn)鍾，将上清移入另外一個離(lí)心管中。再按照(zhào) 1 ml RNA提取試劑使用 200 μl 的比例加入氯仿，用力颠倒離(lí)心管以混勻。常溫靜(jìng)置 2 - 5 分(fēn)鍾使之分(fēn)層後，4℃12,000 g離(lí)心 15 分(fēn)鍾。

注：4℃ 離(lí)心對于降低基因組 DNA 的污染是很重要的。

雜質含量高的樣品一定要使用 2.2 操作(zuò)。該操作(zuò)不僅可(kě)以将大(dà)部分(fēn)雜質離(lí)心去(qù)除，也可(kě)以将大(dà)片段的基因組 DNA 離(lí)心去(qù)除，方便加入氯仿後的分(fēn)層，不過，如(rú)果想同時抽提總 RNA 和基因組 DNA，則使用 2.1操作(zuò)。

加入氯仿後的混勻是非常重要的，否則靜(jìng)止分(fēn)相(xiàng)易出現分(fēn)相(xiàng)倒置，即水相(xiàng)在離(lí)心管下部而有機(jī)相(xiàng)在上部。不推薦振蕩混勻，而推薦直接用手混勻：将管底斜向朝上，手斜向快(kuài)速搖動，使體(tǐ)系成粉色乳狀。

3．RNA沉澱（RNA Precipitation）

小心将上層水相(xiàng)（通常可(kě)吸取550 μl）移至另外一個離(lí)心管中，再加入等體(tǐ)積冰冷(lěng)的異丙醇混勻，常溫放(fàng)置10 - 20 分(fēn)鍾，4℃12000g離(lí)心10min，棄上清，RNA沉澱于管底。

注：

中間層和紅(hóng)色下層置于4℃保存，以便接下去(qù)抽提基因組 DNA。

用冰冷(lěng)的異丙醇能更迅速的沉降RNA。

取上層水相(xiàng)時要特别小心，絕對不要吸入白(bái)色中間層及紅(hóng)色下層。移取水相(xiàng)時要使用小體(tǐ)積移液器：200 μl 移液器，吸頭的尖

嘴要貼在管壁，慢(màn)慢(màn)松手吸出液體(tǐ)。

對于脂肪類組織，包括腦組織，在上清的最上層爲脂肪，取上清時不要吸入，必要時用等體(tǐ)積氯仿對上清再抽提一次。

棄上清後，将離(lí)心管置于離(lí)心機(jī)中快(kuài)甩離(lí)心數秒，再用移液器将殘留液體(tǐ)小心吸出。這是最徹底的去(qù)除上清的方法，比倒掉上清後再将離(lí)心管倒扣在吸水紙上的方法可(kě)靠得(de)多。如(rú)果是雜質含量高的樣品，強烈建議(yì)增加此步操作(zuò)。

4．RNA漂洗（RNA Wash）

4.1 RNA沉澱中加入1ml 75%乙醇（用RNase-free水配制），溫和振蕩離(lí)心管，懸浮沉澱。每1ml RNA提取試劑加入1ml 75％乙醇。

4.2 4℃7,500 g離(lí)心5min，棄上清。

注：轉速不要高于7,500g，否則得(de)到的RNA不易溶解。

4.3短(duǎn)暫快(kuài)速離(lí)心，用移液器小心吸棄上清，注意不要吸棄沉澱。常溫放(fàng)置1-2分(fēn)鍾晾幹沉澱。

注：RNA樣品不要過于幹燥，否則很難溶解。

5. 溶解RNA（Redissolving the RNA）

根據需要，沉澱中加入适量（一般可(kě)加50-100μl）RNase-free水，輕彈管壁，以充分(fēn)溶解RNA，-70℃保存。

實驗示例：

 1.2%瓊脂糖膠   1×TAE 150V 25min RealSafe Red預染

RNA提取試劑提取步驟：K562懸浮細胞，1 ml收集（6×106/ml），PBS漂洗兩遍，加入1 ml RNA提取試劑，懸浮後常溫靜(jìng)置10分(fēn)鍾，加入氯仿或氯仿替代物200 μl，徹底混勻後靜(jìng)置10分(fēn)鍾，自(zì)然分(fēn)相(xiàng)，4度 13000 rpm 離(lí)心15分(fēn)鍾，上清中加入等體(tǐ)積異丙醇，常溫靜(jìng)置20分(fēn)鍾，4度 13000 rpm離(lí)心15分(fēn)鍾，沉澱用1 ml 75%乙醇漂洗，4度 8000rpm 離(lí)心2分(fēn)鍾，沉澱溶于50μl RNase-free水中。

RTR2306操作(zuò)簡述如(rú)下：K562懸浮細胞，1ml收集（6×106/ml），PBS漂洗兩遍（平行做2管）。沉澱中加入350 μl 裂解液RL（已加β-ME），常溫裂解5分(fēn)鍾，裂解物加到DNA清除柱CS中，離(lí)心收集到2 ml離(lí)心管中，離(lí)心管中加入0.5倍體(tǐ)積無水乙醇，全部溶液加到RNA吸附柱CR中，離(lí)心，随後清除柱CS和RNA吸附柱CR一次RD漂洗，2次RW漂洗，最後每個吸附柱用50 μl RNase-free水洗脫，合并兩管得(de)到100 μl RNA和100 μl去(qù)除的基因組DNA。