RealPure普通植物RNA提取試劑盒

RealPure Plant RNA Extraction Kit for Conventional Plants

● 試劑盒内容及保存：

● 儲存條件(jiàn)和效期：

RNase-free水4℃保存；其他(tā)試劑在常溫（25℃左右）幹燥條件(jiàn)下，可(kě)保存1年(nián)。試劑盒常溫運輸。

● 産品簡介：

本試劑盒可(kě)從(cóng)普通植物（拟南(nán)芥，水稻，小麥，煙草，玉米，綠蘿等）葉片、莖、幼苗、果肉中快(kuài)速提取總RNA，可(kě)同時處理(lǐ)大(dà)量不同樣品，20-30分(fēn)鍾内即可(kě)完成反應，提取的總RNA純度高，沒有DNA和蛋白(bái)的污染，可(kě)用于Northern blot、Dot blot、polyA 篩選、體(tǐ)外翻譯、RNase 保護分(fēn)析和分(fēn)子克隆等實驗。

由于植物材料的複雜性，該試劑盒不能提取多糖多酚植物RNA，也不能有效提取植物種子、塊莖、鱗莖的RNA，提取這些材料的RNA請(qǐng)選擇RealPure多糖多酚植物RNA提取試劑盒（Cat：RTR2304）和RealPure植物種子RNA提取試劑盒（Cat：RTR2308）。

● 準備工(gōng)作(zuò)：

1操作(zuò)前在裂解液RL中加入β-巯基乙醇至終濃度1%，如(rú)500 μl RL中加入5 μl β-巯基乙醇。此裂解液最好現用現配。配好的 RL4 ℃可(kě)放(fàng)置3天。

2 按照(zhào)标簽所示在漂洗液RW中加入無水乙醇（自(zì)備），混勻後蓋緊瓶蓋後室溫貯存備用。

3 所有離(lí)心步驟均在常溫下進行。

● 操作(zuò)步驟：

1. 樣品處理(lǐ):

1.1 1.5 ml離(lí)心管中加入500 μl裂解液RL（使用前請(qǐng)先檢查是否已加入β-巯基乙醇）。

注：多糖多酚植物（如(rú)銀杏，毛白(bái)楊等）使用該試劑盒不能提取RNA，請(qǐng)選擇RealPure多糖多酚植物RNA提取試劑盒（Cat：RTR2304）。

背景知識：快(kuài)速判斷是否爲多糖多酚植物

取20mg左右的植物材料，放(fàng)入1.5 ml離(lí)心管中，加入0.5 ml 0.2 M NaOH溶液，95℃ 10分(fēn)鍾，觀察裂解物顔色。顔色爲綠色或淡黃(huáng)色爲普通植物；顔色爲棕黃(huáng)色或棕紅(hóng)色爲多糖多酚植物。

1.2将植物材料加入到液氮預冷(lěng)的研缽中，用研杵研磨，其間不斷加入液氮，直至研磨成粉末狀。取50 mg粉末迅速加入到離(lí)心管中，渦旋劇(jù)烈震蕩混勻，常溫放(fàng)置5分(fēn)鍾。

注：一定不要加入超過50 mg的粉末，否則樣品超過裂解液RL的裂解能力會導緻RNA提取失敗。

背景知識：樣品處理(lǐ)量絕對不要超過RNA吸附柱處理(lǐ)能力，否則造成RNA殘留或者産量降低。不同植物組織種類RNA相(xiàng)差極大(dà)，例如(rú)有些植物種子RNA含量較高，玉米種子RNA含量可(kě)達50 μg/50 mg種子，超過50 mg材料會超過吸附柱吸附能力，導緻提取失敗。所以開始摸索實驗條件(jiàn)時，如(rú)果不清楚樣品RNA含量時甯可(kě)使用較少的樣品處理(lǐ)量，如(rú)植物組織不超過50 mg，随後根據實驗結果增加或者減少處理(lǐ)量。

2. 離(lí)心取上清：

13,000 rpm離(lí)心5 min，小心吸取收集管中的上清至1.5 ml RNase-free的離(lí)心管中，吸頭盡量避免接觸收集管中的細胞碎片沉澱。一般可(kě)獲得(de)400 μl上清。

3. 去(qù)除基因組污染：

上清中加入0.5倍體(tǐ)積的無水乙醇（如(rú)400 μl上清中加入200 μl無水乙醇），混勻（此時可(kě)能會出現沉澱），得(de)到的溶液和沉澱一起轉入DNA清除柱CS（清除柱放(fàng)入收集管中）中，13,000 rpm離(lí)心2分(fēn)鍾，棄掉收集管中的廢液。

注：确保全部溶液都(dōu)收集到收集管中，如(rú)果膜上有殘留液體(tǐ)，延長離(lí)心時間至5分(fēn)鍾，保證膜上無殘留液體(tǐ)。

4. 洗脫RNA：

  将DNA清除柱放(fàng)入一幹淨的2 ml離(lí)心管中，在清除柱中加入500 μl 裂解液RL plus，13,000 rpm離(lí)心1分(fēn)鍾，收集濾液（注意：RNA在濾液中，不要丢棄），濾液中加入250 μl無水乙醇，此時可(kě)能會出現沉澱，立即混勻，不要離(lí)心。

5. RNA挂柱：

  将全部溶液加入到RNA吸附柱CR中（吸附柱放(fàng)入收集管中），13,000 rpm離(lí)心2分(fēn)鍾。

注：确保溶液全部過濾到收集管中，膜上無殘留，如(rú)有必要，可(kě)以延長離(lí)心時間至5分(fēn)鍾。

6. 去(qù)除RNA中的蛋白(bái)污染：

向RNA吸附柱CR中（吸附柱放(fàng)入收集管中）加入500 μl 去(qù)蛋白(bái)液RD，13,000 rpm離(lí)心1分(fēn)鍾，棄廢液。

7. 去(qù)除RNA中的其他(tā)雜質：

向RNA吸附柱CR中加入700 μl漂洗液RW（使用前請(qǐng)先檢查是否已加入乙醇）， 13,000 rpm離(lí)心1分(fēn)鍾，棄廢液。

8. 進一步去(qù)除RNA中的其他(tā)雜質：

向吸附柱CR中加入500 μl漂洗液RW （使用前請(qǐng)先檢查是否已加入乙醇），13,000 rpm離(lí)心1

分(fēn)鍾，棄廢液，将吸附柱CR放(fàng)回收集管中，确保蓋好吸附柱管蓋。

9.  關鍵步驟：徹底去(qù)除吸附柱上的殘餘乙醇：

13,000 rpm将吸附柱CR空甩離(lí)心2 分(fēn)鍾，去(qù)除吸附柱上的殘餘液體(tǐ)。

注：此步驟目的是将吸附柱中殘餘的漂洗液去(qù)除，如(rú)果有漂洗液殘留，可(kě)能會影(yǐng)響後續的RT等實驗操作(zuò)。

10. 洗脫得(de)到RNA：

将RNA吸附柱CR轉入一個新的1.5 ml RNase-free離(lí)心管中，向吸附柱O型墊圈中央懸空加入50-100 μl RNase-free水（事(shì)先65℃預熱(rè)可(kě)提高洗脫效率），蓋好吸附柱管蓋，常溫放(fàng)置2分(fēn)鍾，13,000 rpm離(lí)心2 分(fēn)鍾。

注：确保水要加到膜的中央，不要貼壁加入；洗脫緩沖液體(tǐ)積不應少于50 μl，體(tǐ)積過小影(yǐng)響回收效率。

11. RNA貯存：

RNA樣品-80℃中保存。

● RNA産量和質量的評估：

1. RNA産量：

用分(fēn)光(guāng)光(guāng)度計(jì)測定OD₂₆₀的吸光(guāng)值來(lái)計(jì)算RNA産量。将RNA按照(zhào)一定的比例稀釋于TE溶液（10mMTris pH8.0，1mMEDTA）中，根據以下公式計(jì)算：

A₂₆₀×稀釋倍數×40=μg RNA/ml

注：測定OD值時，盡量不要用RNase-free水稀釋RNA，因爲RNase-free水pH較低，測定的OD值偏低。

2. RNA質量：

凝膠電泳檢測：凝膠電泳中，完整的RNA應該有兩條主帶：28S和18S，并且28S亮度應該與18S相(xiàng)當或是其亮度的2倍。可(kě)以使用普通的1×TAE瓊脂糖凝膠電泳，凝膠濃度1-1.5 %，可(kě)以使用高電壓，短(duǎn)時間電泳，如(rú)7V/cm電泳，20分(fēn)鍾。建議(yì)使用D2000 DNA ladder（Cat：RTM415）作(zuò)爲Marker。植物28S rRNA遷移率與1500bp類似，18S rRNA遷移率與1000bp類似。

吸光(guāng)值檢測：可(kě)以用A₂₃₀，A₂₆₀和A₂₈₀的數值表示RNA的純度。純淨的RNA的 A₂₆₀/A₂₈₀比值應該爲2，我們得(de)到的RNA樣品比值應在1.8-2.2之間，如(rú)果比值低于1.8，表明RNA樣品中蛋白(bái)污染比較嚴重。A₂₆₀/A₂₃₀比值應該在2-2.2之間。如(rú)果此比值低于2，表明RNA樣品中有胍鹽，多糖的污染。

●  實驗示例:

 ●  問(wèn)題指南(nán):

1. 離(lí)心柱發生(shēng)堵塞

離(lí)心柱發生(shēng)堵塞之後會造成 RNA 得(de)率降低甚至不能純化得(de)到 RNA。

常見(jiàn)原因分(fēn)析如(rú)下：

1.1：樣本破碎不徹底。

樣本破碎不徹底會使吸附柱發生(shēng)堵塞，同時會影(yǐng)響 RNA 得(de)率及質量。我們建議(yì)在進行樣本破碎的時候，在足量的液氮中快(kuài)速研磨操作(zuò)，盡量破碎樣本細胞壁、細胞膜等組織。

1.2 樣本初始量過多。

樣本使用量過多會導緻裂解液RL或裂解液RSL裂解細胞時不完全，導緻離(lí)心柱堵塞。RealPure植物RNA提取試劑盒處理(lǐ)樣本的初始最大(dà)量爲50 mg。

1.3 離(lí)心機(jī)的溫度過低。

整個 RNA 分(fēn)離(lí)純化除了液氮破碎樣本組織外，所有的步驟均在常溫（20-25℃）進行。有些低溫離(lí)心機(jī)的溫度低于 20℃，可(kě)能會造成離(lí)心柱的堵塞。如(rú)果發生(shēng)這種現象，請(qǐng)将離(lí)心機(jī)溫度設置到 20-25℃。

2. 提取不到RNA或者RNA産量低

通常會有多種因素影(yǐng)響回收效率，比如(rú)：樣本 RNA 含量、操作(zuò)方法、洗脫體(tǐ)積等。

常見(jiàn)原因分(fēn)析：

2.1  樣本保存不當或樣本保存時間過久導緻RNA 已經降解。

建議(yì)：新采集的樣本應立即放(fàng)入液氮中速凍，長期保存于-70℃并避免樣本的反複凍融；或者将樣本立即浸泡在 RNA 穩定劑RNAwait溶液中。

2.2  樣本破碎裂解不充分(fēn)導緻純化柱堵塞。

建議(yì)：在組織研磨時，請(qǐng)保證組織充分(fēn)研磨，并在研磨完成後迅速轉移至預先準備好的裂解液RL或裂解液RSL（确認已添加正确比例的 β-ME）中。

2.3  洗脫液添加不正确。

建議(yì)：确認 RNase-Free 水滴加到了純化柱膜O型墊圈中央位置。

2.4  漂洗液RW中沒有添加正确體(tǐ)積的無水乙醇。

建議(yì)：請(qǐng)按照(zhào)說(shuō)明書(shū)，在試劑盒使用前，漂洗液RW中添加正确體(tǐ)積的無水乙醇并混勻。

2.5  組織樣本用量不合适。

建議(yì)：每 500 μl 裂解液RL或裂解液 RSL使用最大(dà)組織量50 mg，組織使用過多會導緻 RNA 提取量降低并且得(de)到的 RNA 純度也會降低。我們強烈建議(yì)每單次 RNA提取操作(zuò)，樣本初始用量一定不要超過最大(dà)建議(yì)量。

2.6  洗脫體(tǐ)積不合适或洗脫不徹底。

建議(yì)：純化柱的洗脫液體(tǐ)積爲 50-100 μl；若洗脫效果并不理(lǐ)想，建議(yì)在加入65℃預熱(rè)的RNase-Free 水後，延長常溫放(fàng)置的時間，例如(rú)放(fàng)置 5-10 min。

2.7  純化柱在第二次RW洗滌之後有乙醇殘留。

建議(yì)：漂洗液RW洗滌後，吸附柱空甩離(lí)心2 min是關鍵步驟，以充分(fēn)除去(qù)吸附柱上殘留的乙醇。

2.8  試劑盒使用不正确。

建議(yì)：對于多酚多糖的植物樣本，務必使用緩沖液PRS，這是我們專門(mén)針對多酚多糖植物樣本而研制的多糖多酚去(qù)除劑，如(rú)不添加，将導緻RNA不能挂柱或提取到純度不高的RNA。

3. 純化獲得(de)的RNA有降解

純化得(de)到的 RNA 的質量和樣本的保存、RNase 污染、操作(zuò)等因素有關。

常見(jiàn)原因分(fēn)析：

3.1  組織樣本采集後沒有及時保存。

建議(yì)：組織樣本在收集後若不及時使用，請(qǐng)立即低溫保存于液氮中或經液氮速凍後立即轉移至-70℃長期保存，或者将樣本立即浸泡在 RNA 穩定劑 RNAwait溶液中。提取 RNA 請(qǐng)盡量使用新近采取的組織樣本。

3.2  組織樣本反複凍融。

建議(yì)：組織樣本保存時，最好剪成小段保存，使用時取出其中一部分(fēn)即可(kě)，避免樣本的反複凍融導緻 RNA 的降解。

3.3  操作(zuò)間有 RNase 引入或沒有佩戴一次性手套、口罩等。

建議(yì)：RNA 提取實驗最好在單獨的 RNA 操作(zuò)間進行，并在實驗前清理(lǐ)好實驗桌，實驗時佩戴一次性手套、口罩，最大(dà)程度上避免 RNase 引入導緻的RNA 降解。

3.4  試劑在使用過程中被 RNase 污染。

建議(yì)：更換新的植物總RNA 提取系列試劑盒進行相(xiàng)關實驗。

3.5  RNA 操作(zuò)時所用的離(lí)心管、槍頭等有 RNase 污染。

建議(yì)：确認 RNA 提取時所用到的離(lí)心管、槍頭、移液器等都(dōu)是 RNase-Free。

4. RNA中含有DNA污染

4.1 提取的起始材料超過50 mg

建議(yì)：步驟1-樣品處理(lǐ)時用天平稱取粉末重量，不要超過50 mg，否則樣品的核酸量會超過DNA清除柱CS的處理(lǐ)極限，導緻洗脫下的RNA有基因組DNA的污染。

4.2  省略了步驟3-去(qù)除基因組污染步驟。

建議(yì)：步驟3-去(qù)除基因組污染步驟必不可(kě)少，不能省略。DNA清除柱CS能極大(dà)限度的去(qù)除上清液中的基因組 DNA，使用裂解液RL plus洗脫下的RNA基本無基因組DNA的污染。

4.3  跳(tiào)過了使用去(qù)蛋白(bái)液RD的漂洗步驟（見(jiàn)操作(zuò)步驟第6步）。

建議(yì)：這一步驟對于除去(qù)殘留的 DNA 以及雜質蛋白(bái)十分(fēn)重要，一定不能省略，否則将會導緻純化得(de)到的 RNA 中含有DNA 污染和蛋白(bái)污染。

5. 純化獲得(de)的RNA影(yǐng)響下遊實驗

經吸附柱純化的 RNA，如(rú)果鹽離(lí)子、蛋白(bái)質含量過多會影(yǐng)響下遊實驗，比如(rú)：逆轉錄、Northern Blot 等。

1.  洗脫後的 RNA 有鹽離(lí)子殘留。

建議(yì)：确認漂洗液RW中添加了正确體(tǐ)積的乙醇，并按操作(zuò)說(shuō)明的離(lí)心轉速進行2次RW洗滌吸附柱 （見(jiàn)操作(zuò)步驟第7，8步）。

2.  洗脫後的 RNA 有乙醇殘留。

建議(yì)：确認 RW第二次洗滌後，按操作(zuò)說(shuō)明的對吸附柱進行空管離(lí)心操作(zuò)（見(jiàn)操作(zuò)步驟第9 步），如(rú)果還(hái)有乙醇殘留，可(kě)以将空管離(lí)心後吸附柱開蓋常溫放(fàng)置 5 min，以最大(dà)程度上去(qù)除乙醇殘留。