RealPure Animal Tissues/Cell RNA Extraction Kit

RealPure動物組織/細胞RNA提取試劑盒

● 試劑盒内容及保存：

● 儲存條件(jiàn)和效期：

RNase-free水4℃貯存；其他(tā)試劑在常溫（25℃左右）幹燥條件(jiàn)下，可(kě)保存1年(nián)。試劑盒常溫運輸。

● 産品簡介：

本試劑盒可(kě)從(cóng)動物組織中快(kuài)速提取總RNA， 可(kě)同時處理(lǐ)大(dà)量不同樣品。提取的總RNA純度高，沒有蛋白(bái)和其它雜質的污染，可(kě)用于RT-PCR、Real Time RT-PCR、芯片分(fēn)析、Northern Blot、Dot Blot、PolyA 篩選、體(tǐ)外翻譯、RNase 保護分(fēn)析和分(fēn)子克隆等多種下遊實驗。

● 準備工(gōng)作(zuò)：

1操作(zuò)前在裂解液RL中加入β-巯基乙醇至終濃度1%，如(rú)1 ml RL中加入10 μl β-巯基乙醇。此裂解液最好現用現配。配好的 RL4 ℃可(kě)放(fàng)置3天。

2 按照(zhào)标簽所示在漂洗液RW中加入無水乙醇（自(zì)備），混勻後蓋緊瓶蓋後常溫貯存備用。

3 所有離(lí)心步驟均在常溫下進行。

● 操作(zuò)步驟：

1. 樣品處理(lǐ)和裂解:

1.1 貼壁細胞：

1.1.1直接裂解法：

不需胰酶消化，徹底吸幹淨培養液體(tǐ)後直接加推薦量裂解液 RL（使用前請(qǐng)先檢查是否已加入β-巯基乙醇）（下表）反複吹打細胞裂解，可(kě)以漩渦震蕩，直到看(kàn)不到細胞團爲止，進行步驟2。

1.1. 2 胰蛋白(bái)酶消化法：

确定細胞數量（收集細胞數量請(qǐng)不要超過1×10⁷），吸除培養基，用PBS洗滌細胞，吸除PBS，向細胞中加入胰酶消化液處理(lǐ)細胞，當細胞脫離(lí)容器壁時，加入含有血清的培養基失活胰蛋白(bái)酶，将細胞溶液轉移至1.5 ml離(lí)心管中，300×g離(lí)心5 min，收集細胞沉澱，仔細吸除所有上清，加 350 μl（<5x10⁶細胞）或 600 μl（5x10⁶-1x10⁷細胞）裂解液 RL（使用前請(qǐng)先檢查是否已加入β-巯基乙醇），反複吹打細胞裂解，可(kě)以漩渦震蕩，直到看(kàn)不到細胞團爲止，進行步驟2。

1.2 懸浮細胞：

300×g離(lí)心 5 min收集懸浮細胞（收集細胞數量請(qǐng)不要超過1×10⁷）到一個1.5ml 離(lí)心管中，完全吸棄上清，加 350 μl（<5x10⁶細胞）或 600 μl（5x10⁶-1x10⁷細胞）裂解液 RL（使用前請(qǐng)先檢查是否已加入β-巯基乙醇），反複吹打細胞裂解，可(kě)以漩渦震蕩，直到看(kàn)不到細胞團爲止，進行步驟2。

   1.3 動物組織：

       新鮮組織加入350 μl(<20mg 組織)或者 600 μl(20-30mg 組織)的裂解液RL（使用前請(qǐng)先檢查是否已加入β-巯基乙醇）後玻璃勻漿器或電動勻漿器将組織徹底研磨勻漿，進行步驟2。

注意：組織量一定不要超過30 mg，否則将導緻RNA得(de)率和質量下降。

背景知識：樣品處理(lǐ)量絕對不要超過DNA/RNA吸附柱處理(lǐ)能力，否則造成DNA/RNA殘留或者産量降低。不同組織細胞種類DNA/RNA相(xiàng)差極大(dà)，例如(rú)胸腺脾髒DNA含量豐富，超過5 mg就(jiù)會超過柱子處理(lǐ)能力。COS細胞RNA含量豐富，超過3x10⁶細胞就(jiù)會超過柱子吸附能力。所以開始摸索實驗條件(jiàn)時，如(rú)果不清楚樣品DNA/RNA含量時甯可(kě)使用較少的樣品處理(lǐ)量，如(rú)細胞不超過3-4x10⁶，組織不超過10mg，随後根據實驗結果增加或者減少處理(lǐ)量。

2. 離(lí)心得(de)到上清：

若沒有不溶性沉澱，直接進行步驟3。如(rú)有不能裂解的碎片或者不溶物，13,000 rpm離(lí)心5 min, 取裂解物上清進行下一步。

3. 去(qù)除基因組污染和洗脫RNA：

将DNA清除柱CS放(fàng)入一幹淨的2 ml離(lí)心管内，用移液器小心将步驟1離(lí)心管内的溶液或步驟2離(lí)心後的上清全部轉移到DNA清除柱CS中，13,000 rpm離(lí)心2分(fēn)鍾（RNA在離(lí)心管濾液中,不要丢棄）。

注：确保全部溶液都(dōu)收集到2 ml離(lí)心管中，如(rú)果膜上有殘留液體(tǐ)，延長離(lí)心時間至5分(fēn)鍾，保證膜上無殘留液體(tǐ)。

4. RNA挂柱：

  向2 ml離(lí)心管濾液中加入0.5倍體(tǐ)積的無水乙醇（如(rú)濾液體(tǐ)積爲300 μl/600 μl，加入150 μl/300 μl無水乙醇），此時可(kě)能會出現沉澱，立即混勻，不要離(lí)心。将全部溶液加入到RNA吸附柱CR中（吸附柱放(fàng)入收集管中），13,000 rpm離(lí)心1分(fēn)鍾。

注：确保溶液全部過濾到收集管中，膜上無殘留，如(rú)有必要，可(kě)以延長離(lí)心時間至5分(fēn)鍾。

5. 去(qù)除RNA中的蛋白(bái)污染：

向RNA吸附柱CR中（吸附柱放(fàng)入收集管中）加入500 μl 去(qù)蛋白(bái)液RD，13,000 rpm離(lí)心1分(fēn)鍾，棄廢液。

6. 去(qù)除RNA中的其他(tā)雜質：

向RNA吸附柱CR中加入700 μl漂洗液RW（使用前請(qǐng)先檢查是否已加入乙醇）， 13,000 rpm離(lí)心1分(fēn)鍾，棄廢液。

7. 進一步去(qù)除RNA中的其他(tā)雜質：

向吸附柱CR中加入500 μl漂洗液RW （使用前請(qǐng)先檢查是否已加入乙醇），13,000 rpm離(lí)心1

分(fēn)鍾，棄廢液。

8.  關鍵步驟：徹底去(qù)除吸附柱上的殘餘乙醇：

将吸附柱CR放(fàng)回收集管中，确保蓋好吸附柱管蓋，13,000 rpm将吸附柱CR空甩離(lí)心2 分(fēn)鍾，去(qù)除吸附柱上的殘餘液體(tǐ)。

注：此步驟目的是将吸附柱中殘餘漂洗液去(qù)除，如(rú)果有漂洗液殘留，可(kě)能會影(yǐng)響後續的RT等實驗操作(zuò)。

9. 洗脫得(de)到RNA：

将RNA吸附柱CR轉入一個新的1.5 ml RNase-free離(lí)心管中，向吸附柱O型墊圈中央懸空加入50-100 μl RNase-free水（事(shì)先65℃預熱(rè)可(kě)提高洗脫效率），蓋好吸附柱管蓋，常溫放(fàng)置2分(fēn)鍾，13,000 rpm離(lí)心2 分(fēn)鍾。

注：确保水要加到膜的中央，不要貼壁加入；洗脫緩沖液體(tǐ)積不應少于50 μl，體(tǐ)積過小影(yǐng)響回收效率。

10.  RNA貯存：

RNA樣品-80℃中保存。

● RNA産量和質量的評估：

1. RNA産量：

用分(fēn)光(guāng)光(guāng)度計(jì)測定OD₂₆₀的吸光(guāng)值來(lái)計(jì)算RNA産量。将RNA按照(zhào)一定的比例稀釋于TE溶液（10mMTris pH8.0，1mMEDTA）中，根據以下公式計(jì)算：

A₂₆₀×稀釋倍數×40=μg RNA/ml

注：測定OD值時，盡量不要用RNase-free水稀釋RNA，因爲RNase-free水pH較低，測定的OD值偏低。

2. RNA質量：

凝膠電泳檢測：凝膠電泳中，動物的完整RNA應該有兩條主帶：28S和18S，并且28S亮度應該與18S相(xiàng)當或是其亮度的2倍。可(kě)以使用普通的1×TAE瓊脂糖凝膠電泳，凝膠濃度1-1.5 %，可(kě)以使用高電壓，短(duǎn)時間電泳，如(rú)7V/cm電泳，20分(fēn)鍾。建

議(yì)使用D2000 DNA ladder（Cat：RTM415）作(zuò)爲Marker。28S rRNA遷移率與1800bp類似，18S rRNA遷移率與700bp類似。

吸光(guāng)值檢測：可(kě)以用A₂₃₀，A₂₆₀和A₂₈₀的數值表示RNA的純度。純淨的RNA的 A₂₆₀/A₂₈₀比值應該爲2，我們得(de)到的RNA樣品比值應在1.8-2.2之間，如(rú)果比值低于1.8，表明RNA樣品中蛋白(bái)污染比較嚴重。A₂₆₀/A₂₃₀比值應該在2-2.2之間。如(rú)果此比值低于2，表明RNA樣品中有胍鹽的污染。

 ● 實驗示例:

                          1.2%瓊脂糖膠   1×TAE 150V 25min RealSafe Red預染

RNA提取試劑提取步驟：K562懸浮細胞，1 ml收集（6×10⁶/ml），PBS漂洗兩遍，加入1 ml RNA提取試劑，懸浮後常溫靜(jìng)置10分(fēn)鍾，加入氯仿或氯仿替代物200 μl，徹底混勻後靜(jìng)置10分(fēn)鍾，自(zì)然分(fēn)相(xiàng)，4度 13000 rpm 離(lí)心15分(fēn)鍾，上清中加入等體(tǐ)積異丙醇，常溫靜(jìng)置20分(fēn)鍾，4度 13000 rpm離(lí)心15分(fēn)鍾，沉澱用1 ml 75%乙醇漂洗，4度 8000rpm 離(lí)心2分(fēn)鍾，沉澱溶于50μl RNase-free水中。

RTR2306操作(zuò)簡述如(rú)下：K562懸浮細胞，1ml收集（6×10⁶/ml），PBS漂洗兩遍（平行做2管）。沉澱中加入350 μl 裂解液RL（已加β-ME），常溫裂解5分(fēn)鍾，裂解物加到DNA清除柱CS中，離(lí)心收集到2 ml離(lí)心管中，離(lí)心管中加入0.5倍體(tǐ)積無水乙醇，全部溶液加到RNA吸附柱CR中，離(lí)心，随後清除柱CS和RNA吸附柱CR一次RD漂洗，2次RW漂洗，最後每個吸附柱用50 μl RNase-free水洗脫，合并兩管得(de)到100 μl RNA和100 μl去(qù)除的基因組DNA。

● 問(wèn)題指南(nán):

1. 離(lí)心柱發生(shēng)堵塞

離(lí)心柱發生(shēng)堵塞之後會造成 RNA 得(de)率降低甚至不能純化得(de)到 RNA。

常見(jiàn)原因分(fēn)析如(rú)下：

1.1組織或細胞破碎不徹底。

破碎不徹底會使吸附柱發生(shēng)堵塞，同時會影(yǐng)響 RNA 得(de)率及質量。我們建議(yì)在進行裂解時，盡量借助輔助手段如(rú)機(jī)械勻漿徹底破碎組織。

1.2 樣本初始量過多。

樣本使用量過多會導緻裂解液RL裂解細胞時不完全，導緻離(lí)心柱堵塞。該試劑盒處理(lǐ)樣本的初

始最大(dà)量10⁷細胞或30 mg組織。

1.3 離(lí)心機(jī)的溫度過低。

整個 RNA 分(fēn)離(lí)純化所有的步驟均在常溫（20-25℃）進行。有些低溫離(lí)心機(jī)的溫度低于 20℃，可(kě)能會造成離(lí)心柱的堵塞。如(rú)果發生(shēng)這種現象，請(qǐng)将離(lí)心機(jī)溫度設置到 20-25℃。

2. 提取不到RNA或者RNA産量低

通常會有多種因素影(yǐng)響回收效率，比如(rú)：樣本 RNA 含量、操作(zuò)方法、洗脫體(tǐ)積等。

常見(jiàn)原因分(fēn)析：

2.1  樣本保存不當或樣本保存時間過久導緻RNA 已經降解。

建議(yì)：新采集的樣本應立即放(fàng)入液氮中速凍，長期保存于-70℃并避免樣本的反複凍融；或者将樣本立即浸泡在 RNA 穩定劑RNAwait溶液中。

2.2  樣本破碎裂解不充分(fēn)導緻純化柱堵塞。

建議(yì)：參見(jiàn)1。

2.3  洗脫液添加不正确。

建議(yì)：确認 RNase-Free 水滴加到了純化柱膜O型墊圈中央位置。

2.4  漂洗液RW中沒有添加正确體(tǐ)積的無水乙醇。

建議(yì)：請(qǐng)按照(zhào)說(shuō)明書(shū)，在試劑盒使用前，漂洗液RW中添加正确體(tǐ)積的無水乙醇并混勻。

2.5  組織樣本用量不合适。

建議(yì)：每 600 μl 裂解液RL使用最大(dà)細胞量爲1×10⁷，使用最大(dà)組織量爲30 mg，過多會導緻 RNA 提取量降低并且得(de)到的 RNA 純度也會降低。我們強烈建議(yì)每單次 RNA提取操作(zuò)，樣本初始用量一定不要超過最大(dà)建議(yì)量。

2.6  洗脫體(tǐ)積不合适或洗脫不徹底。

建議(yì)：純化柱的洗脫液體(tǐ)積爲 50-100 μl；若洗脫效果并不理(lǐ)想，建議(yì)在加入65℃預熱(rè)的RNase-Free 水後，延長常溫放(fàng)置的時間，例如(rú)放(fàng)置 5-10 min。

2.7  純化柱在第二次RW洗滌之後有乙醇殘留。

建議(yì)：漂洗液RW洗滌後，吸附柱空甩離(lí)心2 min是關鍵步驟，以充分(fēn)除去(qù)吸附柱上殘留的乙醇。

3. 純化獲得(de)的RNA有降解

純化得(de)到的 RNA 的質量和樣本的保存、RNase 污染、操作(zuò)等因素有關。

常見(jiàn)原因分(fēn)析：

3.1  組織樣本采集後沒有及時保存。

建議(yì)：組織樣本在收集後若不及時使用，請(qǐng)立即低溫保存于液氮中或經液氮速凍後立即轉移至-70℃

長期保存，或者将樣本立即浸泡在 RNA 穩定劑 RNAwait溶液中。提取 RNA 請(qǐng)盡量使用新近采取的組織樣本。

3.2  組織樣本反複凍融。

建議(yì)：組織樣本保存時，最好分(fēn)裝成小份，使用時取出其中一份即可(kě)，避免樣本的反複凍融導緻 RNA 的降解。

3.3  操作(zuò)間有 RNase 引入或沒有佩戴一次性手套、口罩等。

建議(yì)：RNA 提取實驗最好在單獨的 RNA 操作(zuò)間進行，并在實驗前清理(lǐ)好實驗桌，實驗時佩戴一次性手套、口罩，最大(dà)程度上避免 RNase 引入導緻的RNA 降解。

3.4  試劑在使用過程中被 RNase 污染。

建議(yì)：更換新的提取試劑盒進行相(xiàng)關實驗。

3.5  RNA 操作(zuò)時所用的離(lí)心管、槍頭等有 RNase 污染。

建議(yì)：确認 RNA 提取時所用到的離(lí)心管、槍頭、移液器等都(dōu)是 RNase-Free。

4. RNA中含有DNA污染

4.1 提取的起始材料量超過最大(dà)建議(yì)量

建議(yì)：步驟1-樣品處理(lǐ)時使用10⁷細胞或30 mg組織，不要超過最大(dà)處理(lǐ)量，否則樣品的核酸量會超過DNA清除柱CS的處理(lǐ)極限，導緻洗脫下的RNA有基因組DNA的污染。

4.2  省略了步驟3-去(qù)除基因組污染步驟。

建議(yì)：步驟3-去(qù)除基因組污染步驟必不可(kě)少，不能省略。DNA清除柱CS能極大(dà)限度的去(qù)除上清液中的基因組 DNA，使用裂解液RL洗脫下的RNA基本無基因組DNA的污染。

4.3  跳(tiào)過了使用去(qù)蛋白(bái)液RD的漂洗步驟（見(jiàn)操作(zuò)步驟第5步）。

建議(yì)：這一步驟對于除去(qù)殘留的 DNA 以及雜質蛋白(bái)十分(fēn)重要，一定不能省略，否則将會導緻純化得(de)到的 RNA 中含有DNA 污染和蛋白(bái)污染。

5. 純化獲得(de)的RNA影(yǐng)響下遊實驗

經吸附柱純化的 RNA，如(rú)果鹽離(lí)子、蛋白(bái)質含量過多會影(yǐng)響下遊實驗，比如(rú)：逆轉錄、Northern Blot 等。

1.  洗脫後的 RNA 有鹽離(lí)子殘留。

建議(yì)：确認漂洗液RW中添加了正确體(tǐ)積的乙醇，并按操作(zuò)說(shuō)明的離(lí)心轉速進行2次RW洗滌吸附柱 （見(jiàn)操作(zuò)步驟第6，7步）。

2.  洗脫後的 RNA 有乙醇殘留。