RealPure^®Plant Seed RNA Extraction Kit

RealPure^®植物種子RNA提取試劑盒

● 試劑盒内容及保存：

● 儲存條件(jiàn)和效期：

RNase-free水4℃保存；其他(tā)試劑在常溫（25℃左右）幹燥條件(jiàn)下，可(kě)保存1年(nián)。試劑盒常溫運輸。

● 産品簡介：

本試劑盒可(kě)從(cóng)植物種子中快(kuài)速提取總RNA，通過獨特的裂解系統，快(kuài)速去(qù)除植物組織中的澱粉、多糖等成分(fēn)，釋放(fàng) RNA。試劑盒配套緩沖液PRS（Phenolic Remove Solution）可(kě)以去(qù)除種子中的多糖多酚對RNA提取的影(yǐng)響。另外，試劑盒配套DNA清除柱，可(kě)以消除基因組DNA的污染。整個提取過程僅需20-30分(fēn)鍾内即可(kě)完成，可(kě)以從(cóng)50 mg植物種子中提取數十微克高純度RNA，基本沒有DNA和蛋白(bái)的污染，可(kě)用于Northern blot、Dot blot、polyA 篩選、體(tǐ)外翻譯、RNase 保護分(fēn)析和分(fēn)子克隆等實驗。

已經測試的植物種子有：拟南(nán)芥幹種子、小麥幹種子、水稻幹種子、芝麻種子、玉米幹種子、豌豆種子、紅(hóng)豆幹種子、綠豆幹種子、向日(rì)葵種子、西瓜種子、油莎豆、花生(shēng)、大(dà)豆等。另外，該試劑盒也适合于提取塊莖、鱗莖的RNA。

植物RNA提取介紹：

由于植物種類繁多，不同的植物種類和部位的樣品使用本試劑盒效果不同。我們已經測試成功的植物列表如(rú)下：

注：+ 表示添加，-表示不添加， +/- 表示添加不添加均可(kě)， NA表示無數據

● 準備工(gōng)作(zuò)：

1操作(zuò)前在裂解液RSL中加入β-巯基乙醇至終濃度5%，如(rú)500 μl RSL中加入25 μl β-巯基乙醇。此裂解液最好現用現配。配好的 RSL4 ℃可(kě)放(fàng)置3天。

2 按照(zhào)标簽所示在漂洗液RW中加入無水乙醇（自(zì)備），混勻後蓋緊瓶蓋後常溫貯存備用。

3 準備65℃水浴

4 所有離(lí)心步驟均在常溫下進行。

● 操作(zuò)步驟：

1. 樣品處理(lǐ):

1.1 1.5 ml RNase-free離(lí)心管中加入500 μl裂解液RSL（使用前請(qǐng)先檢查是否已加入β-巯基乙醇），50 μl緩沖液PRS混勻備用。

   注：緩沖液PRS有助于去(qù)除樣品中的多糖和多酚，禾本科(kē)植物如(rú)水稻，小麥和玉米的種子RNA提取中可(kě)以不用添加；如(rú)不能判斷材料是否含多糖和多酚，請(qǐng)加入緩沖液PRS。

1.2将種子加入到液氮預冷(lěng)的研缽中，用研杵研磨，其間不斷加入液氮，直至研磨成粉末狀。取20-50 mg粉末迅速加入到離(lí)心管中，渦旋劇(jù)烈震蕩混勻，65℃水浴放(fàng)置5分(fēn)鍾，間歇混勻。

注：一定不要加入超過50 mg的粉末，否則樣品超過裂解液RSL的裂解能力導緻RNA提取失敗。

2. 離(lí)心取上清：

13,000 rpm離(lí)心5 min，小心吸取收集管中的上清至1.5 ml RNase-free的離(lí)心管中，吸頭盡量避免接觸收集管中的細胞碎片沉澱。一般可(kě)獲得(de)400 μl上清。

注：一些種子富含油脂如(rú)花生(shēng)種子，離(lí)心後脂肪位于最上層，用吸頭穿越脂肪層吸取上清；禾本科(kē)植物如(rú)水稻，小麥，玉米，高粱種子會有大(dà)量沉澱生(shēng)産。

3. 去(qù)除基因組污染：

上清中加0.5倍體(tǐ)積的無水乙醇（如(rú)400 μl上清中加入200 μl無水乙醇），混勻（此時可(kě)能會出現沉澱），得(de)到的溶液和沉澱一起轉入DNA清除柱CS（清除柱放(fàng)入收集管中）中，13,000 rpm離(lí)心2分(fēn)鍾，棄掉收集管中的廢液。

注：吸附柱的最大(dà)容積是850 μl，超過此體(tǐ)積分(fēn)步上柱，确保全部溶液都(dōu)通過過濾柱，如(rú)果膜上有殘留液體(tǐ)，延長離(lí)心時間至5分(fēn)鍾，保證膜上無殘留液體(tǐ)。

4. 洗脫RNA：

  将DNA清除柱放(fàng)入2 m l RNase-free離(lí)心管中，在清除柱中加入500 μl 裂解液RL plus，13,000 rpm離(lí)心1分(fēn)鍾，收集濾液（注意：RNA在濾液中，不要丢棄），濾液中加入250 μl無水乙醇，此時可(kě)能會出現沉澱，立即混勻，不要離(lí)心。

5. RNA挂柱：

  将全部溶液加入到RNA吸附柱CR中（吸附柱放(fàng)入收集管中），13,000 rpm離(lí)心2分(fēn)鍾，棄廢液。

注：确保溶液全部過濾到收集管中，膜上無殘留，如(rú)有必要，可(kě)以延長離(lí)心時間至5分(fēn)鍾。

6. 去(qù)除RNA中的蛋白(bái)污染：

向RNA吸附柱CR中（吸附柱放(fàng)入收集管中）加入500 μl 去(qù)蛋白(bái)液RD，13,000 rpm離(lí)心1分(fēn)鍾，棄廢液。

7. 去(qù)除RNA中的其他(tā)雜質：

向RNA吸附柱CR中加入700 μl漂洗液RW（使用前請(qǐng)先檢查是否已加入乙醇）， 13,000 rpm離(lí)心1分(fēn)鍾，棄廢液。

8. 進一步去(qù)除RNA中的其他(tā)雜質：

向吸附柱CR中加入500 μl漂洗液RW （使用前請(qǐng)先檢查是否已加入乙醇），13,000 rpm離(lí)心1

分(fēn)鍾，棄廢液。

9.  關鍵步驟：徹底去(qù)除吸附柱上的殘餘乙醇：

将吸附柱CR放(fàng)回收集管中，确保蓋好吸附柱管蓋，13,000 rpm将吸附柱CR空甩離(lí)心2 分(fēn)鍾，去(qù)除吸附柱上的殘餘液體(tǐ)。

注：此步驟目的是将吸附柱中殘餘的漂洗液去(qù)除，如(rú)果有漂洗液殘留，可(kě)能會影(yǐng)響後續的RT等實驗操作(zuò)。

10. 洗脫得(de)到RNA：

将RNA吸附柱CR轉入一個新的1.5 ml RNase-free離(lí)心管中，向吸附柱O型墊圈中央懸空加入50-100 μl RNase-free水（事(shì)先65℃預熱(rè)可(kě)提高洗脫效率），蓋好吸附柱管蓋，常溫放(fàng)置2分(fēn)鍾，13,000 rpm離(lí)心2 分(fēn)鍾。

注：确保水要加到膜的中央，不要貼壁加入；洗脫緩沖液體(tǐ)積不應少于50 μl，體(tǐ)積過小影(yǐng)響回收效率。

11. RNA貯存：

RNA樣品-80℃中保存。

● RNA産量和質量的評估：

1. RNA産量：

用分(fēn)光(guāng)光(guāng)度計(jì)測定OD₂₆₀的吸光(guāng)值來(lái)計(jì)算RNA産量。将RNA按照(zhào)一定的比例稀釋于TE溶液（10mMTris pH8.0，1mMEDTA）中，根據以下公式計(jì)算：

A₂₆₀×稀釋倍數×40=μg RNA/ml

注：測定OD值時，盡量不要用RNase-free水稀釋RNA，因爲RNase-free水pH較低，測定的OD值偏低。

2. RNA質量：

凝膠電泳檢測：凝膠電泳中，完整的RNA應該有兩條主帶：28S和18S，并且28S亮度應該與18S相(xiàng)當或是其亮度的2倍。可(kě)以使用普通的1×TAE瓊脂糖凝膠電泳，凝膠濃度1.5 %，可(kě)以使用高電壓，短(duǎn)時間電泳，如(rú)7V/cm電泳，20分(fēn)鍾。建議(yì)使用D2000 DNA ladder（Cat：RTM415）作(zuò)爲Marker。植物28S rRNA遷移率與1500 bp類似，18S rRNA遷移率與1000bp類似。

吸光(guāng)值檢測：可(kě)以用A₂₃₀，A₂₆₀和A₂₈₀的數值表示RNA的純度。純淨的RNA的 A₂₆₀/A₂₈₀比值應該爲2，我們得(de)到的RNA樣品比值應在1.8-2.2之間，如(rú)果比值低于1.8，表明RNA樣品中蛋白(bái)污染比較嚴重。

A₂₆₀/A₂₃₀比值應該在2-2.2之間。如(rú)果此比值低于2，表明RNA樣品中有胍鹽，多糖的污染。

實驗示例：