T4連接酶
T4 DNA ligase
貨号：RTT2101
● 産品組成：
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名稱
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規格
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T4 DNA ligase (5U/μl)
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100 U (20μl)
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10×T4 DNA Ligation Buffer
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0.2 ml
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50%PEG Solution
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0.15 ml
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● 保存：-20℃
● 産品簡介：
T4 DNA
Ligase 是從(cóng)表達T4
DNA Ligase 基因的大(dà)腸杆菌經誘導表達後分(fēn)離(lí)純化而來(lái)的，催化相(xiàng)鄰DNA鏈的5’磷酸基團和3’羟基基團以磷酸二酯鍵結合反應。該酶可(kě)催化平末端或粘性末端DNA之間的連接，還(hái)可(kě)修複雙鏈DNA、RNA、DNA/RNA雜交雙鏈中的單鏈切口。本品可(kě)應用于DNA插入片段和載體(tǐ)DNA的粘性末端和平末端的連接，以及線性DNA的自(zì)身(shēn)環化。
活性定義：此酶的活力單位爲Weiss Unit。1個Weiss
Unit相(xiàng)當于約200個粘性末端連接單位（cohesive-end
ligation unit, CEU）。1個CEU單位定義爲在20 μl的連接反應體(tǐ)系中，在16℃30分(fēn)鍾内，能使50%的經HindIII消化的λDNA片段連接所需的酶量。
● 注意事(shì)項
1．T4
DNA Ligase的最終用量不要超過推薦的用量，否則影(yǐng)響連接效率。
2．PEG可(kě)以極大(dà)提高平末端的連接效率，我們推薦加入終濃度爲5%
PEG Solution以提高平末端的連接效率。
3．爲了提高轉化效率，轉化時建議(yì)所加入連接産物的量不要超過感受态細胞體(tǐ)積的10%。
4．由于T4
DNA Ligase中含有甘油，比較粘稠容易挂壁，建議(yì)使用前短(duǎn)暫離(lí)心将液體(tǐ)收集到管底，取樣時槍頭盡量不要深入液面太深以免粘在槍頭上造成損失。
● 使用方法：
一
DNA片段和載體(tǐ)DNA的連接
1）粘性末端的連接
1．反應體(tǐ)系:
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10μl體(tǐ)系
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終濃度
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線性載體(tǐ)DNA
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x μl
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10-50 ng
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插入DNA片段
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y μl
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插入片段：載體(tǐ)=1:1-5:1*
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10×ligation
buffer
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1 μl
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1×
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T4 DNA
ligase(5U/μl)
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0.1 μl
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0.5 U
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ddH2O
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up to 10 μl
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*：載體(tǐ)與插入片段的摩爾數比需要優化：一般vector:insert在1:1~1:5之間均可(kě)得(de)到較好的結果。用以下公式計(jì)算片段摩爾數：pmol數= DNA量(ng)/(660×片段bp數)×1000。例如(rú)：插入片段2000bp，線性載體(tǐ)爲3000bp，如(rú)果載體(tǐ)使用量爲50ng（0.025pmol），10μl連接體(tǐ)系中vector:insert的摩爾比是1:3，則需要2000bp pmol數爲0.075pmol，插入片段2000bp的使用量爲100ng。
2．徹底輕柔混勻後，瞬間離(lí)心，将管壁上的溶液收集到管底。
3．反應條件(jiàn)：16℃孵育30分(fēn)鍾。
4．可(kě)取5
μl連接産物熱(rè)擊轉化50
μl感受态細胞或取1-2
μl連接産物電擊轉化50
μl感受态細胞。
注：1）若要提高電轉實驗效率，推薦65℃孵育10分(fēn)鍾或70℃孵育5分(fēn)鍾以滅活T4 DNA Ligase後，用DNA産物純化試劑盒對連接後的DNA片段進行純化後進行電擊轉化。
2）若要提高轉化子數目，可(kě)将連接時間延長至1小時。
3）在10
μl連接體(tǐ)系中若T4連接酶的終濃度大(dà)于1
U，必須對連接後的DNA片段進行純化後方可(kě)進行電轉。
2）平末端的連接
1．反應體(tǐ)系:
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10μl體(tǐ)系
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終濃度
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線性平末端載體(tǐ)DNA*
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x μl
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10-50 ng
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插入DNA片段
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y μl
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插入片段：載體(tǐ)=1:1-5:1**
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10×ligation
buffer
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1 μl
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1×
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T4 DNA
ligase(5U/μl)
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0.5 μl
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2.5 U
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50% PEG
solution
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1 μl
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5%
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ddH2O
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up to 10 μl
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*：平滑末端的載體(tǐ)與 DNA 片段進行連接時，應首先将載體(tǐ)進行去(qù)磷酸化處理(lǐ)，以防止其自(zì)身(shēn)環化。
**：載體(tǐ)與插入片段的摩爾數比需要優化：一般vector:insert在1:1~1:5之間均可(kě)得(de)到較好的結果。用以下公式計(jì)算片段摩爾數：pmol數= DNA量(ng)/(660×片段bp數)×1000。例如(rú)：插入片段2000bp，線性載體(tǐ)爲3000bp，如(rú)果載體(tǐ)使用量爲50ng（0.025pmol），10μl連接體(tǐ)系中vector:insert的摩爾比是1:3，則需要2000bp pmol數爲0.075pmol，插入片段2000bp的使用量爲100ng。
2．徹底輕柔混勻後，瞬間離(lí)心，将管壁上的溶液收集到管底。
3．反應條件(jiàn)：16℃孵育30分(fēn)鍾。
4．可(kě)取5
μl連接産物熱(rè)擊轉化50
μl感受态細胞或取1-2
μl連接産物電擊轉化50
μl感受态細胞。
注：1）由于平末端連接體(tǐ)系中，T4 ligase用量較大(dà)，若要提高電轉實驗效率，推薦65℃孵育10分(fēn)鍾或70℃孵育5分(fēn)鍾以滅活T4
DNA Ligase後，用DNA産物純化試劑盒或氯仿抽提對連接後的DNA片段進行純化後才能進行電擊轉化。
2）若要提高轉化子數目，可(kě)将連接時間延長至1小時。
二 線性DNA的自(zì)身(shēn)環化
1．反應體(tǐ)系:
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50μl體(tǐ)系
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終濃度
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線性載體(tǐ)DNA
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x μl
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10-50 ng
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10×ligation
buffer
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5 μl
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1×
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T4 DNA
ligase(5U/μl)
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1 μl
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5 U
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ddH2O
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up to 50 μl
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2．徹底輕柔混勻後，瞬間離(lí)心，将管壁上的溶液收集到管底。
3．反應條件(jiàn)：16℃孵育30分(fēn)鍾。
4．可(kě)取5
μl連接産物熱(rè)擊轉化50
μl感受态細胞或取1-2
μl連接産物電擊轉化50
μl感受态細胞。
注：1）若要提高電轉實驗效率，推薦65℃孵育10分(fēn)鍾或70℃孵育5分(fēn)鍾滅活T4 DNA Ligase後，用DNA産物純化試劑盒或氯仿抽提對連接後的DNA片段進行純化後才能進行電擊轉化。
三 接頭連接
1．反應體(tǐ)系:
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20μl體(tǐ)系
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終濃度
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線性DNA
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x μl
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100-500 ng
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磷酸化接頭
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y μl
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1-2 μg
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10×ligation
buffer
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2 μl
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1×
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50% PEG
solution
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2 μl
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5%
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T4 DNA
ligase(5U/μl)
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0.4 μl
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2 U
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ddH2O
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up to 20 μl
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2．徹底輕柔混勻後，瞬間離(lí)心，将管壁上的溶液收集到管底。
3．反應條件(jiàn)：16℃孵育30分(fēn)鍾。
4．65℃孵育10分(fēn)鍾或70℃孵育5分(fēn)鍾滅活T4
DNA Ligase。連接産物可(kě)以直接進行限制性内切酶酶切反應。