植物原生(shēng)質體(tǐ)制備及轉化試劑盒plus                           

●  産品組成：

● 産品簡介：

植物原生(shēng)質體(tǐ)是指脫去(qù)全部細胞壁由質膜包被的具有生(shēng)命活力的裸露細胞。它具有細胞生(shēng)命特征和全能型，是細胞無性系變異和突變體(tǐ)篩選的重要來(lái)源，同時也是植物遺傳工(gōng)程的理(lǐ)想受體(tǐ)和遺傳改良的理(lǐ)想材料。酶解法分(fēn)離(lí)原生(shēng)質體(tǐ)是一個常用的技術(shù)，其原理(lǐ)是植物細胞壁主要由纖維素、半纖維素和果膠質組成，因而使用纖維素酶、半纖維素酶、離(lí)析酶和果膠酶能降解細胞壁成分(fēn)，去(qù)除細胞壁，即可(kě)得(de)到原生(shēng)質體(tǐ)。許多方法可(kě)誘導原生(shēng)質體(tǐ)融合，現在被廣泛采用的融合方法是聚乙二醇（PEG）法。聚乙二醇（PEG）作(zuò)爲一種高分(fēn)子化合物，合适的濃度能對原生(shēng)質體(tǐ)産生(shēng)瞬間沖擊效應，原生(shēng)質體(tǐ)很快(kuài)發生(shēng)收縮與粘連，随後用高鈣高pH法進行清洗，使原生(shēng)質體(tǐ)融合得(de)以完成。

按照(zhào)每次使用5 ml酶消化體(tǐ)系計(jì)算，本試劑盒可(kě)用于40次酶消化反應。本試劑盒每個5 ml反應體(tǐ)系可(kě)處理(lǐ)0.1 g左右的拟南(nán)芥葉片(約10~15葉片)，操作(zuò)較好的情況下每5 ml體(tǐ)系可(kě)獲得(de)約50-70萬個原生(shēng)質體(tǐ)(不同植物不同操作(zuò)會有一定的差異)，可(kě)滿足約25-70個樣品的原生(shēng)質體(tǐ)質粒轉染操作(zuò)(按照(zhào)每個樣品1-2萬個細胞計(jì)算)。

原生(shēng)質體(tǐ)轉化時，本試劑盒可(kě)以用于相(xiàng)當于6孔闆40個孔的樣品，12孔闆80個孔的樣品，或24孔闆160個孔的樣品的轉化。

● 貯存和效期：

-20oC保存，至少一年(nián)有效。

組分(fēn)I，II，III，V  4℃存放(fàng)3-5天不會影(yǐng)響使用效果，長期不用，按照(zhào)标簽℃貯存。

試劑盒常溫運輸。

● 使用說(shuō)明：

   需要準備的材料（試劑盒不提供）：

   剪尖吸頭（剪尖後可(kě)以用酒精燈過火(huǒ)将吸頭處理(lǐ)平滑）；平頭鑷子；70 μm細胞過濾篩；一次性刀片；50 ml離(lí)心管；1.5 ml離(lí)心管；水浴鍋。

一、原生(shēng)質體(tǐ)分(fēn)離(lí)：

即用型酶溶液配制

注：即用型酶溶液現用現配，不建議(yì)配制後凍存後再使用；

溶解好的正常酶溶液應爲澄清棕黃(huáng)色溶液，如(rú)使用純度不好的酶，溶液爲不溶解的乳白(bái)色懸濁液，不能使用。

1. 酶解：

取生(shēng)長狀态良好的葉片切成0.5-1 mm的小條，按照(zhào)0.1 克葉片（拟南(nán)芥約15-20個葉片）加5 ml即用型酶溶液的比例迅速将切割好的葉片小條浸泡于酶溶液中，避光(guāng)，無需震蕩，常溫（20-25℃）酶解3小時，間歇混勻。

注：酶解時間與葉片種類，葉片生(shēng)長狀态有關，請(qǐng)根據實驗需要适當調整酶解時間。3小時爲拟南(nán)芥葉片推薦的酶解時間。如(rú)條件(jiàn)允許，可(kě)以使用微型真空泵常溫避光(guāng)條件(jiàn)下抽真空30 min，以使酶溶液更好地進入細胞間隙。酶溶液變爲綠色表明有原生(shēng)質體(tǐ)已經有分(fēn)離(lí)，溶液爲濃綠色表明原生(shēng)質體(tǐ)已經大(dà)量分(fēn)離(lí)。拟南(nán)芥原生(shēng)質體(tǐ)大(dà)小約爲30-50 μm，顯微鏡鏡檢後确定是否分(fēn)離(lí)。葉片原生(shēng)質體(tǐ)細胞顯微鏡下爲綠色圓球狀，葉綠體(tǐ)分(fēn)散在整個細胞内，說(shuō)明狀态較好；如(rú)呈現不規則形狀，說(shuō)明原生(shēng)質

體(tǐ)破碎或即将破碎。

  2. 漂洗：

酶解後加入等體(tǐ)積的溶液II，如(rú)使用5 ml酶解體(tǐ)系，加入5 ml溶液II，輕柔混勻。

3. 過濾：

用孔徑70 μm篩網過濾步驟2中的溶液，去(qù)除未消化的葉片，收集濾出液于50 ml離(lí)心管中。

4. 第一次收集：

濾出液100g常溫離(lí)心 2分(fēn)鍾，盡量去(qù)除上清。

注：爲了避免原生(shēng)質體(tǐ)離(lí)心時貼在管壁，建議(yì)整個實驗過程使用水平轉頭；離(lí)心時，可(kě)調低離(lí)心機(jī)的升速和降速。升速過快(kuài)，原生(shēng)質體(tǐ)可(kě)能離(lí)到管壁上；降速過快(kuài)，可(kě)能導緻管底原生(shēng)質體(tǐ)懸起。

5. 第二次收集：

加入2-5 ml 溶液II，用剪尖的藍吸頭重懸原生(shēng)質體(tǐ)，冰浴30分(fēn)鍾，原生(shēng)質體(tǐ)在重力作(zuò)用下可(kě)以沉降到離(lí)心管底部，盡量吸除上清，收集原生(shēng)質體(tǐ)。(如(rú)果發現原生(shēng)質體(tǐ)沉降的速度比較慢(màn)或者得(de)率比較低，也可(kě)以考慮常溫100 g離(lí)心1-2 min收集原生(shēng)質體(tǐ))。

6. 重懸：

小心去(qù)除上清溶液，不要觸動原生(shēng)質體(tǐ)沉澱，沉澱用剪尖的藍吸頭重懸于1 ml溶液III中即爲原生(shēng)質體(tǐ)溶液。（可(kě)以用血球計(jì)數闆計(jì)數，根據原生(shēng)質體(tǐ)數量調整溶液III的加入體(tǐ)積，使得(de)原生(shēng)質體(tǐ)密度爲2×10⁵/ml或更高）。

注：制備好的原生(shēng)質體(tǐ)可(kě)以在4oC或冰浴保存至少24 h。

二、原生(shēng)質體(tǐ)轉化和培養：

  1. 轉化溶液配制：

植物原生(shēng)質體(tǐ)轉化參考下表根據樣品量配制轉化溶液。

轉化溶液現用現配。轉化溶液需要在轉化前至少1小時配制，以确保轉化試劑溶解充分(fēn)。轉化溶液配制後盡量當天使用。配制好的轉化溶液4℃保存3-5天之内仍然有較好的轉化效率，但(dàn)和當天配制的轉化溶液相(xiàng)比，轉化效果可(kě)能會有一定程度的下降。

2. 準備質粒：

取10 μl質粒DNA(10-20 μg，濃度爲1-2 μg/μl)于1.5 ml 離(lí)心管中。

注：質粒大(dà)小建議(yì)爲5-10 kb，質粒濃度爲1-2 μg/μl左右；

原生(shēng)質體(tǐ)轉化對于質粒的純度要求較高，盡量使用高純度的質粒。

3. 質粒轉化：

3.1 質粒管中加入100 μl原生(shēng)質體(tǐ)溶液（原生(shēng)質體(tǐ)密度爲2×10⁵/ml，約2萬個原生(shēng)質體(tǐ)），輕柔混勻。

3.2 加入等體(tǐ)積即110 μl 步驟1事(shì)先準備好的轉化溶液，輕彈管底，輕柔混勻，常溫25℃放(fàng)置5-15分(fēn)鍾。

注：最長可(kě)以孵育15 min，但(dàn)通常孵育5min時間已經足夠。最佳的孵育時間對于不同的原生(shēng)質體(tǐ)和不同的質粒需要通過實驗摸索。

4. 終止轉化：

加入2倍體(tǐ)積即440 μl 溶液II，輕柔徹底混勻，終止轉化過程。

5. 收集原生(shēng)質體(tǐ)：

常溫100g離(lí)心1-2分(fēn)鍾，盡量去(qù)除上清。

注：由于轉化後的溶液會非常粘稠，加入溶液II後離(lí)心1 min通常可(kě)以使原生(shēng)質體(tǐ)聚集在管底，但(dàn)使用某些突變體(tǐ)時爲減少原生(shēng)質體(tǐ)損失，可(kě)将離(lí)心時間延長到2 min。

6. 原生(shēng)質體(tǐ)漂洗：

  加入500 μl溶液II用剪尖藍吸頭輕輕重懸原生(shēng)質體(tǐ)，常溫100g離(lí)心1 min，盡量去(qù)除殘留的上清。

注：本步驟可(kě)以充分(fēn)去(qù)除殘留的轉染試劑溶液中的組分(fēn)，避免轉染試劑溶液中的組分(fēn)對于後續的不良影(yǐng)響。

7. 原生(shēng)質體(tǐ)重懸：

沉澱中加入1 ml溶液V，用剪尖藍吸頭輕柔重懸。

8. 原生(shēng)質體(tǐ)培養：

将離(lí)心管水平放(fàng)置，23-25oC弱光(guāng)培養。

注：根據實驗需求确定孵育時間。RNA分(fēn)析孵育2-6小時；酶活性分(fēn)析和蛋白(bái)标記實驗孵育2-16小時；基因編輯的效果在轉染24小時後可(kě)能被檢測到。

三、實驗示例：

使用原生(shēng)質體(tǐ)植物原生(shēng)質體(tǐ)制備及轉化試劑盒轉染拟南(nán)芥原生(shēng)質體(tǐ)的效果圖。

實驗步驟：稱取0.48 g轉化試劑于2 ml 離(lí)心管中，加入轉化試劑溶解液後，颠倒混勻，蒸餾水定容至2 ml，使轉化試劑充分(fēn)溶解後備用。在2 ml的圓底離(lí)心管中加入10 μl（20 μg）EGFP質粒 (植物用綠色熒光(guāng)蛋白(bái))，加入100 μl制備好的原生(shēng)質體(tǐ)，輕柔混勻後加入110 μl當日(rì)配制好的轉化試劑溶液，輕柔混勻，常溫靜(jìng)置5 min後加入440 μl溶液II終止轉化，輕輕颠倒混勻，常溫100 g離(lí)心1 min，去(qù)除上清，再加入0.5 ml溶液II，輕柔重懸原生(shēng)質體(tǐ)，常溫100 g離(lí)心1 min後，盡量去(qù)除上清，收集原生(shēng)質體(tǐ)。加入1 ml溶液V，小心重懸原生(shēng)質體(tǐ)後水平放(fàng)置25℃培養過夜(約16h)，次日(rì)于熒光(guāng)顯微鏡下檢測EGFP熒光(guāng)信号。

四、 産品發表文章(zhāng)：

1 TaEXPB7-B,a-expansin gene involved in low-temperature stress and abscisic acid responses, promotes growth and cold resistance in Arabidopsis thaliana.

Xu Feng, Yongqing Xu, Lina Peng, Xingyu Yu, Qiaoqin Zhao, Shanshan Feng, Ziyi Zhao, Fenglan Li, Baozhong Hu. 

J Plant Physiology 2019 https://doi.org/10.1016/j.jplph.2019.153004

2 Involvement of the chloroplast gene ferredoxin 1 in multiple responses of Nicotiana benthamiana to Potato virus X infection.

Xue Yang, Yuwen Lu, Fang Wang, Ying Chen, Yanzhen Tian, Liangliang Jiang, Jiejun Peng, Hongying Zheng, Lin Lin, Chengqi Yan, Michael Taliansky, Stuart MacFarlane, Yuanhua Wu,  Jianping Chen，Fei Yan.

Journal of Experimental Botany, 2020，71（6）2142–2156, doi:10.1093/jxb/erz565

植物原生(shēng)質體(tǐ)提取試劑盒發表文章(zhāng)列表

1. [IF=3.19] TaEXPB7-B,a -expansin gene involved in low-temperature stress and abscisic acid responses, promotes growth and cold resistance in Arabidopsis thaliana.

實驗植物：小麥

Author: Xu Feng, Yongqing Xu, Lina Peng, Xingyu Yu, Qiaoqin Zhao, Shanshan Feng, Ziyi Zhao, Fenglan Li, Baozhong Hu.

Journal: J Plant Physiology 2019

Institution：  College of Life Sciences, Northeast Agricultural University

Paper link：http://www.plantphysiol.org/content/174/4/2487

2. [IF=5.36] Involvement of the chloroplast gene ferredoxin 1 in multiple responses of Nicotiana benthamiana to Potato virus X infection. 

實驗植物：煙草

Author: Xue Yang, Yuwen Lu, Fang Wang, Ying Chen, Yanzhen Tian, Liangliang Jiang, Jiejun Peng, Hongying Zheng, Lin Lin, Chengqi Yan, Michael Taliansky, Stuart MacFarlane, Yuanhua Wu,  Jianping Chen and Fei Yan

Journal: Journal of Experimental Botany, 2020，Vol.71, No. 6,2142–2156, 

Institution：Institute of Plant Virology, Ningbo University 

Paper link：https://academic.oup.com/jxb/article/71/6/2142/5686178?login=true

3. [IF=7.228]  Turnip mosaic virus impairs perinuclear chloroplast clustering to facilitate viral infection

實驗植物：煙草

Author:Yushan Zhai, Quan Yuan, Shiyou Qiu, Saisai Li, Miaomiao Li, Hongying Zheng, Guanwei Wu, Yuwen Lu, Jiejun Peng, Shaofei Rao, Jianping Chen, Fei Yan

Journal: Plant Cell Enviroment, 2021，30 July 

Institution：Institute of Plant Virology, Ningbo University 

Paper link：https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/pce.14157

4. [IF=5.64]  A Novel, Small Cysteine-Rich Effector, RsSCR10 in Rhizoctonia solani Is Sufficient to Trigger Plant Cell Death

實驗植物：水稻

Author:Xianyu Niu, Guijing Yang, Hui Lin, Yao Liu, Ping Li and Aiping Zheng

Journal: Fronties in Microbiology August 2021 | Volume 12 | Article 684923 

Institution：Sichuan Agricultural University

Paper link：https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fmicb.2021.684923/full

5. [IF=9.8]  Synthesis of flavour-related linalool is regulated by PpbHLH1 and associated with changes in DNA methylation during peach fruit ripening

實驗植物：煙草

Author: Chunyan Wei, Hongru Liu, Xiangmei Cao, Minglei Zhang, Xian Li, Kunsong Chen and Bo Zhang

Journal: Plant Biotechnology Journal (2021) 19, pp. 2082–2096 

Institution：Laboratory of Fruit Quality Biology/Zhejiang Provincial Key Laboratory of Horticultural Plant Integrative Biology, Zhejiang University

Paper link：https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/pbi.13638

6. [2020IF=1.04]  EoPHR2, a Phosphate Starvation Response Transcription Factor, Is Involved in Improving Low-Phosphorus Stress Resistance in Eremochloa ophiuroides

實驗植物：拟南(nán)芥

Author: Ying Chen1,#, Chuanqiang Liu1,#, Qingqing He1, Jianjian Li2, Jingjing Wang2, Ling Li2, Xiang Yao2, Shenghao Zhou3, Haoran Wang

Journal: Phyton Vol.91, No.3, 2022, pp.651-665

Institution： Institute of Botany, Jiangsu Province and Chinese Academy of Sciences

Paper link：https://www.techscience.com/phyton/v91n3/45309

7. [2021IF=3.2]  Establishment and optimization of PEG-mediated protoplast transformation in the microalga Haematococcus pluvia

實驗材料：雨(yǔ)生(shēng)紅(hóng)球藻 Haematococcus pluvia

Author: Chunli Guo，Muhammad Anwar， Rui Mei，Xinyi Li， Di Zhao，Yanan Jiang， Jieyi Zhuang， Chen Liu，Chaogang Wang， Zhangli Hu

Journal: Journal of Applied Phycology. Published online 07 March 2022

Institution：College of Optoelectronic Engineering, Shenzhen University

Paper link： https://link.springer.com/article/10.1007/s10811-022-02718-x

8. [2021 IF=5.9] The Genome-Wide Identification of Long Non-Coding RNAs Involved in Floral Thermogenesis in Nelumbo nucifera Gaertn

實驗材料：睡蓮 Nelumbo nucifera Gaertn

Author: Jing Jin , Yu Zou, Ying Wang, Yueyang Sun, Jing Peng and Yi Ding

Journal: Int. J. Mol. Sci. 2022, 23, 4901.

Institution：College of Life Sciences, Guizhou University，College of Life Sciences, Wuhan University

Paper link： https://www.mdpi.com/1422-0067/23/9/4901

9. [2021 IF=17.9] Genome-wide association analysis reveals a novel pathway mediated by a dual-TIR domainprotein for pathogen resistance in cotton

實驗材料：棉花

Author: Yihao Zhang, Yaning Zhang, Xiaoyang Ge, Yuan Yuan, Yuying Jin, Ye Wang, Lihong Zhao, Xiao Han, Wei Hu, Lan Yang, Chenxu Gao, Xi Wei, Fuguang Li, Zhaoen Yang

Journal: Genome Biology  (2023) 24:111

Institution：Institute of Cotton Research, Chinese Academy of Agricultura Sciences

Paper link： https://doi.org/10.1186/s13059-023-02950-9

10. [2022 IF=7.4] Rose long noncoding RNA lncWD83 promotes flowerin by modulating ubiquitination of the floral repressor RcMYC2L

實驗材料：Rose 玫瑰

Author: Chen Yeqing ,Lu  Jun ,Wang Weinan ,Fan Chunguo ,Yuan Guozhen ,Sun  Jingjing ,Liu  Jinyi ,Wang Changquan

Journal: Plant Physiol (2023) Published: 19 September 2023

Institution：College of Horticulture, Nanjing Agricultural University

Paper link： https://doi.org/10.1093/plphys/kiad502

11. [2022 IF=17.4] Functionalized carbon nano-enabled plant ROS signal engineering for growth / defense balance

實驗材料：拟南(nán)芥

Author: Zhijiang Guo , Qiong Chen , Taibo Liang , Baoyuan Zhou , Suhua Huang , Xiufeng Cao, Xiuli Wang , Zaisong Ding, Jiangping Tu

Journal: Nano Today 53 (2023) 102045

Institution：School of Materials Science and Engineering, Zhejiang University

Paper link：https://doi.org/10.1016/j.nantod.2023.102045

12. [2022 IF=13.8] Unveiling the mechanism of broad-spectrum blast resistance in rice: The collaborative role of transcription factor OsGRAS30 and histone deacetylase OsHDAC1

實驗材料：水稻

Author: Jiaqi Hou, Huangzhuo Xiao, Peng Yao, Xiaoci Ma, Qipeng Shi, Jin Yang, Haoli Hou and Lijia Li

Journal: Plant Biotechnology Journal (2024), pp. 1–17

Institution：State Key Laboratory of Hybrid Rice, College of Life Sciences, Wuhan University

Paper link：https://doi.org/10.1111/pbi.14299

13. [2022 IF=7.2] NnSnRK1-NnATG1-mediated autophagic cell death governs flower bud abortion in shaded lotus

實驗材料：荷花

Author: Xiehongsheng Li, Yingchun Xu, Zongyao Wei, Jiaying Kuang, Mingzhao She, Yanjie Wang and Qijiang Jin

Journal: Plant J (2024) 117, 979–998

Institution：College of Horticulture, Nanjing Agricultural University

Paper link： https://doi.org/10.1111/tpj.16655