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植物原生(shēng)質體(tǐ)制備試劑盒

植物原生(shēng)質體(tǐ)制備試劑盒

産品編号:RTU4082

産品規格:20次

數量
價格 ¥700

植物原生(shēng)質體(tǐ)制備試劑盒                                        

 

貨号

名稱

包裝

RTU4082

植物原生(shēng)質體(tǐ)制備試劑盒

5 ml×20

 

●  産品組成:

序号

組分(fēn)貨号

名稱

規格

貯存

運輸

1

RTU4082-01

溶液I-酶溶解溶液(2×)

50 ml

-20℃

RT

2

RTU4082-02

溶液II-漂洗溶液(5×)

50 ml

-20℃

RT

3

RTU4082-03

溶液III-重懸溶液

25 ml

-20℃

RT

4

BME

還(hái)原劑

1 ml

RT

RT

5

BSA-02

50mg/ml BSA溶液

5 ml

-20℃

RT

6

CYL0014

Enzyme Premix酶混合物

2 g

-20℃

RT

7

RT-1070

70 μm細胞過濾器

5/

RT

RT

 

 

說(shuō)明書(shū)

一份

 

 

産品簡介:

植物原生(shēng)質體(tǐ)是指脫去(qù)全部細胞壁由質膜包被的具有生(shēng)命活力的裸露細胞。它具有細胞生(shēng)命特征和全能型,是細胞無性系變異和突變體(tǐ)篩選的重要來(lái)源,同時也是植物遺傳工(gōng)程的理(lǐ)想受體(tǐ)和遺傳改良的理(lǐ)想材料。酶解法分(fēn)離(lí)原生(shēng)質體(tǐ)是一個常用的技術(shù),其原理(lǐ)是植物細胞壁主要由纖維素、半纖維素和果膠質組成,因而使用纖維素酶、半纖維素酶、離(lí)析酶和果膠酶能降解細胞壁成分(fēn),去(qù)除細胞壁,即可(kě)得(de)到原生(shēng)質體(tǐ)。試劑盒配套的酶混合物是纖維素酶R-10和離(lí)析酶R-10的混合物,優化的酶配比能很好地消化植物細胞壁,提取到良好的植物原生(shēng)質體(tǐ)。

按照(zhào)每次使用5 ml酶消化體(tǐ)系計(jì)算,本試劑盒可(kě)用于20次酶消化反應。本試劑盒每個5 ml反應體(tǐ)系可(kě)處理(lǐ)0.1 g左右的拟南(nán)芥葉片(約10~15葉片),操作(zuò)較好的情況下每5 ml體(tǐ)系可(kě)獲得(de)約50-70萬個原生(shēng)質體(tǐ)(不同植物不同操作(zuò)會有一定的差異),可(kě)滿足約25-70個樣品的原生(shēng)質體(tǐ)質粒轉染操作(zuò)(按照(zhào)每樣1-2萬個細胞計(jì)算)。

本試劑盒不含有原生(shēng)質體(tǐ)轉化試劑,需要轉化請(qǐng)參見(jiàn)植物原生(shēng)質體(tǐ)轉化試劑盒(RTU4092 )。

貯存、效期及運輸:

  按照(zhào)标簽溫度保存,至少一年(nián)有效。-20℃貯存組分(fēn)4℃存放(fàng)3-4不會影(yǐng)響使用效果。3-4天經常使用的情況,可(kě)以全部保存在4℃。

試劑盒常溫運輸。

使用說(shuō)明:

   需要準備的材料(試劑盒不提供):

   平頭鑷子;一次性刀片;50 ml離(lí)心管;1.5 ml離(lí)心管;水浴鍋

一、原生(shēng)質體(tǐ)分(fēn)離(lí):

即用型酶溶液配制

 

5 ml配制量

溶液I

2.5 ml

酶混合物

0.095

55℃處理(lǐ)10分(fēn)鍾,間歇混勻,冷(lěng)卻到常溫後加入以下試劑

還(hái)原劑

2.5 μl

50mg/ml BSA

0.1 ml

滅菌水

定容至5 ml

注:溶液I容易被微生(shēng)物污染,使用時須嚴格按照(zhào)無菌操作(zuò)規範進行或者适當分(fēn)裝後使用。

55℃處理(lǐ)能滅活核酸酶和蛋白(bái)酶并促進酶的溶解;

即用型酶溶液現用現配,不建議(yì)配制後凍存後再使用;

溶解好的正常酶溶液應爲澄清棕黃(huáng)色溶液,如(rú)使用純度不好的酶,溶液爲不溶解的乳白(bái)色懸濁液,不能使用。

1. 酶解:

注:酶解時間與葉片種類,葉片生(shēng)長狀态有關,請(qǐng)根據實驗需要适當調整酶解時間。3小時爲拟南(nán)芥葉片推薦的酶解時間。如(rú)條件(jiàn)允許,可(kě)以使用微型真空泵常溫避光(guāng)條件(jiàn)下抽真空30 min,以使酶溶液更好地進入細胞間隙。酶溶液變爲綠色表明有原生(shēng)質體(tǐ)已經有分(fēn)離(lí),溶液爲濃綠色表明原生(shēng)質體(tǐ)已經大(dà)量分(fēn)離(lí)。拟南(nán)芥原生(shēng)質體(tǐ)大(dà)小約爲30-50 μm,顯微鏡鏡檢後确定是否分(fēn)離(lí)。葉片原生(shēng)質體(tǐ)細胞顯微鏡下爲綠色圓球狀,葉綠體(tǐ)分(fēn)散在整個細胞内,說(shuō)明狀态較好;如(rú)呈現不規則形狀,說(shuō)明原生(shēng)質

體(tǐ)破碎或即将破碎。


  

 2. 漂洗:

        取适量溶液II-漂洗溶液(5×),用超純水稀釋爲1×漂洗溶液。

 

1×漂洗溶液

組份

50 ml配制量

溶液II-漂洗溶液(5×)

10 ml

滅菌水

40 ml

酶解後加入等體(tǐ)積的1×漂洗溶液,如(rú)使用5 ml酶解體(tǐ)系,加入5 ml 1×漂洗溶液,輕柔混勻。

3. 過濾:

用孔徑70 μm篩網過濾步驟2中的溶液,去(qù)除未消化的葉片,用5-10 ml 1×漂洗溶液沖洗酶解器皿和未消化的葉片1-2次,将所有的液體(tǐ)收到50 ml離(lí)心管中。

4. 第一次收集:

濾出液100g常溫離(lí)心 2分(fēn)鍾,盡量去(qù)除上清。

注:爲了避免原生(shēng)質體(tǐ)離(lí)心時貼在管壁,建議(yì)整個實驗過程使用水平轉頭;離(lí)心時,可(kě)調低離(lí)心機(jī)的升速和降速。升速過快(kuài),原生(shēng)質體(tǐ)可(kě)能離(lí)到管壁上;降速過快(kuài),可(kě)能導緻管底原生(shēng)質體(tǐ)懸起。建議(yì)升速和降速分(fēn)别都(dōu)使用3。

5. 第二次收集:

加入2-5 ml 1×漂洗溶液,用剪尖的藍吸頭重懸原生(shēng)質體(tǐ),冰浴30分(fēn)鍾,原生(shēng)質體(tǐ)在重力

作(zuò)用下可(kě)以沉降到離(lí)心管底部,盡量吸除上清,收集原生(shēng)質體(tǐ)。(如(rú)果發現原生(shēng)質體(tǐ)沉降的速度比較慢(màn)或者得(de)率比較低,也可(kě)以考慮常溫100 g離(lí)心1-2 min收集原生(shēng)質體(tǐ))。

6. 重懸:

小心去(qù)除上清溶液,不要觸動原生(shēng)質體(tǐ)沉澱,沉澱用剪尖的藍吸頭重懸于1 ml溶液III中即爲原生(shēng)質體(tǐ)溶液。(可(kě)以用血球計(jì)數闆計(jì)數,根據原生(shēng)質體(tǐ)數量調整溶液III的加入體(tǐ)積,使得(de)原生(shēng)質體(tǐ)密度爲2×105/ml或更高)。

注:制備好的原生(shēng)質體(tǐ)可(kě)以在4oC或冰浴保存至少24 h。

二、實驗示例:


                使用植物原生(shēng)質體(tǐ)制備試劑盒轉染拟南(nán)芥原生(shēng)質體(tǐ)的效果圖。

實驗步驟:稱取0.48 g轉化試劑于2 ml 離(lí)心管中,加入轉化試劑溶解液後,颠倒混勻,蒸餾水定容至2 ml,使轉化試劑充分(fēn)溶解後備用。在2 ml的圓底離(lí)心管中加入10 μl(20 μg)EGFP質粒 (植物用綠色熒光(guāng)蛋白(bái)),加入100 μl制備好的原生(shēng)質體(tǐ),輕柔混勻後加入110 μl當日(rì)配制好的轉化試劑溶液,輕柔混勻,常溫靜(jìng)置5 min後加入440 μl 1×漂洗溶液終止轉化,輕輕颠倒混勻,常溫100 g離(lí)心1 min,去(qù)除上清,再加入0.5 ml 1×漂洗溶液,輕柔重懸原生(shēng)質體(tǐ),常溫100 g離(lí)心1 min後,盡量去(qù)除上清,收集原生(shēng)質體(tǐ)。加入1 ml溶液V,小心重懸原生(shēng)質體(tǐ)後水平放(fàng)置25℃培養過夜(約16h),次日(rì)于熒光(guāng)顯微鏡下檢測EGFP熒光(guāng)信号。


植物原生(shēng)質體(tǐ)提取試劑盒發表文章(zhāng)列表

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實驗植物:小麥

Author: Xu Feng, Yongqing Xu, Lina Peng, Xingyu Yu, Qiaoqin Zhao, Shanshan Feng, Ziyi Zhao, Fenglan Li, Baozhong Hu.

Journal: J Plant Physiology 2019

Institution  College of Life Sciences, Northeast Agricultural University

Paper linkhttp://www.plantphysiol.org/content/174/4/2487

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實驗植物:煙草

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Journal: Journal of Experimental Botany, 2020Vol.71, No. 6,2142–2156, 

InstitutionInstitute of Plant Virology, Ningbo University 

Paper linkhttps://academic.oup.com/jxb/article/71/6/2142/5686178?login=true

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Journal: Plant Cell Enviroment, 202130 July 

InstitutionInstitute of Plant Virology, Ningbo University 

Paper linkhttps://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/pce.14157

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Author:Xianyu Niu, Guijing Yang, Hui Lin, Yao Liu, Ping Li and Aiping Zheng

Journal: Fronties in Microbiology August 2021 | Volume 12 | Article 684923 

InstitutionSichuan Agricultural University

Paper linkhttps://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fmicb.2021.684923/full

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Author: Chunyan Wei, Hongru Liu, Xiangmei Cao, Minglei Zhang, Xian Li, Kunsong Chen and Bo Zhang

Journal: Plant Biotechnology Journal (2021) 19, pp. 2082–2096 

InstitutionLaboratory of Fruit Quality Biology/Zhejiang Provincial Key Laboratory of Horticultural Plant Integrative Biology, Zhejiang University

Paper linkhttps://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/pbi.13638

6. [2020IF=1.04]  EoPHR2, a Phosphate Starvation Response Transcription Factor, Is Involved in Improving Low-Phosphorus Stress Resistance in Eremochloa ophiuroides

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Author: Ying Chen1,#, Chuanqiang Liu1,#, Qingqing He1, Jianjian Li2, Jingjing Wang2, Ling Li2, Xiang Yao2, Shenghao Zhou3, Haoran Wang

Journal: Phyton Vol.91, No.3, 2022, pp.651-665

Institution Institute of Botany, Jiangsu Province and Chinese Academy of Sciences

Paper linkhttps://www.techscience.com/phyton/v91n3/45309

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Author: Chunli GuoMuhammad Anwar Rui MeiXinyi Li Di ZhaoYanan Jiang Jieyi Zhuang Chen LiuChaogang Wang Zhangli Hu

Journal: Journal of Applied Phycology. Published online 07 March 2022

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Paper link https://link.springer.com/article/10.1007/s10811-022-02718-x

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Paper link https://www.mdpi.com/1422-0067/23/9/4901

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Journal: Genome Biology  (2023) 24:111

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Journal: Plant Physiol (2023) Published: 19 September 2023

InstitutionCollege of Horticulture, Nanjing Agricultural University

Paper link https://doi.org/10.1093/plphys/kiad502

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Journal: Nano Today 53 (2023) 102045

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Paper linkhttps://doi.org/10.1016/j.nantod.2023.102045

 

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Journal: Plant Biotechnology Journal (2024), pp. 1–17

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Paper linkhttps://doi.org/10.1111/pbi.14299

 

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Journal: Plant J (2024) 117, 979–998

InstitutionCollege of Horticulture, Nanjing Agricultural University

Paper link https://doi.org/10.1111/tpj.16655

 


 
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