植物原生(shēng)質體(tǐ)轉化試劑盒
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貨号
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名稱
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包裝
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RTU4092
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植物原生(shēng)質體(tǐ)轉化試劑盒
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40次
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● 産品組成：
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序号
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組分(fēn)貨号
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名稱
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規格
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貯存
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運輸
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1
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RTU4092-01
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轉化終止溶液
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50
ml
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-20℃
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RT
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2
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RTU4092-02
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轉化試劑
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5
ml
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-20℃
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RT
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3
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RTU4092-03
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培養溶液
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50
ml
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-20℃
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RT
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4
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說(shuō)明書(shū)
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一份
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● 産品簡介：
植物原生(shēng)質體(tǐ)是指脫去(qù)全部細胞壁由質膜包被的具有生(shēng)命活力的裸露細胞。它具有細胞生(shēng)命特征和全能型，是細胞無性系變異和突變體(tǐ)篩選的重要來(lái)源，同時也是植物遺傳工(gōng)程的理(lǐ)想受體(tǐ)和遺傳改良的理(lǐ)想材料。植物原生(shēng)質體(tǐ)轉化試劑盒(Plant Protoplasts Transformation Kit)采用的是聚乙二醇轉化方法，借助聚乙二醇短(duǎn)時間内對原生(shēng)質體(tǐ)産生(shēng)的沖擊效應，使質粒DNA、RNA或蛋白(bái)得(de)以進入原生(shēng)質體(tǐ)，經轉化的植物原生(shēng)質體(tǐ)經過一定時間培養後，可(kě)用于檢測外源基因的表達和功能，轉化後基因敲除或基因編輯效果等。
對于拟南(nán)芥原生(shēng)質體(tǐ)，使用本試劑盒轉化質粒後通常2-6小時可(kě)以檢測相(xiàng)關基因的轉錄變化(mRNA等RNA的變化)，通常2-16小時後可(kě)以檢測到相(xiàng)關蛋白(bái)表達的變化，通常24小時可(kě)以檢測到基因編輯的效果。
本試劑盒可(kě)以用于相(xiàng)當于6孔闆40個孔的樣品，12孔闆20個孔的樣品，或24孔闆40個孔的樣品的轉化。
本試劑盒不含有原生(shēng)質體(tǐ)制備試劑，需要制備原生(shēng)質體(tǐ)請(qǐng)參見(jiàn)植物原生(shēng)質體(tǐ)制備試劑盒（RTU4082 ）。
● 貯存和效期：
按照(zhào)溫度貯存，有效期一年(nián)。轉化試劑現用現配。
試劑盒常溫運輸。
● 使用說(shuō)明：
需要準備的材料（試劑盒不提供）：
平頭鑷子；一次性刀片；50ml離(lí)心管；1.5ml離(lí)心管；水浴鍋
一、原生(shēng)質體(tǐ)轉化步驟：
1. 轉化溶液配制：
植物原生(shēng)質體(tǐ)轉化參考下表根據樣品量配制轉化溶液。
轉化溶液現用現配。轉化溶液需要在轉化前至少1小時配制，以确保轉化試劑溶解充分(fēn)。轉化溶液配制後盡量當天使用。配制好的轉化溶液4℃保存3-5天之内仍然有較好的轉化效率，但(dàn)和當天配制的轉化溶液相(xiàng)比，轉化效果可(kě)能會有一定程度的下降。
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120 μl
（1個樣品）
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1.2 ml
（10個樣品）
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5 ml
(約40個樣品)
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轉化試劑粉末
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48
mg
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480
mg
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2
g
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轉化試劑溶解液（2×）
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60
μl
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0.6
ml
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2.5
ml
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滅菌水
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定容至120 μl
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定容至1.2 ml
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定容至5 ml
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2. 準備質粒：
取10 μl質粒DNA(10-20
μg，濃度爲1-2 μg/μl)于1.5 ml 離(lí)心管中。
注：質粒大(dà)小建議(yì)爲5-10
kb，質粒濃度爲1-2 μg/μl左右；原生(shēng)質體(tǐ)轉化對于質粒的純度要求較高，盡量使用高純度的質粒。多個質粒同時轉化時的體(tǐ)積和總質量保持不變。多個質粒轉化時，每種質粒的用量比例，需要酌情自(zì)行調整。質粒轉化也可(kě)以在12或24孔闆中進行，轉化體(tǐ)系也可(kě)以按照(zhào)比例放(fàng)大(dà)或縮小。本試劑盒中描述的用量相(xiàng)當于是6孔闆中的用量。原生(shēng)質體(tǐ)用多孔闆培養時，最好選擇未經表面處理(lǐ)的多孔闆。對于經過表面處理(lǐ)的動物細胞培養用多孔闆，可(kě)以使用5%胎牛血清或小牛血清處理(lǐ)孔表面數秒，這樣有助于減小孔底表面對于原生(shēng)質體(tǐ)的損傷。
3. 質粒轉化：
3.1 質粒管中加入100 μl原生(shēng)質體(tǐ)溶液（原生(shēng)質體(tǐ)密度爲2×105/ml，約2萬個原生(shēng)質體(tǐ)），輕柔混勻。
3.2 加入等體(tǐ)積即110 μl 步驟1事(shì)先準備好的轉化溶液，輕彈管底，輕柔混勻，常溫25℃放(fàng)置5-15分(fēn)鍾。
注：最長可(kě)以孵育15 min，但(dàn)通常孵育5min時間已經足夠。最佳的孵育時間對于不同的原生(shēng)質體(tǐ)和不同的質粒需要通過實驗摸索。
4. 終止轉化：
加入2倍體(tǐ)積轉化終止溶液即440 μl，輕柔徹底混勻，終止轉化過程。
5. 收集原生(shēng)質體(tǐ)：
常溫100g離(lí)心1-2分(fēn)鍾，盡量去(qù)除上清。
注：由于轉化後的溶液會非常粘稠，加入轉化終止溶液後離(lí)心1 min通常可(kě)以使原生(shēng)質體(tǐ)聚集在管底，但(dàn)使用某些突變體(tǐ)時爲減少原生(shēng)質體(tǐ)損失，可(kě)将離(lí)心時間延長到2 min。爲了避免原生(shēng)質體(tǐ)離(lí)心時貼在管壁，建議(yì)整個實驗過程使用水平轉頭；離(lí)心時，可(kě)調低離(lí)心機(jī)的升速和降速。升速過快(kuài)，原生(shēng)質體(tǐ)可(kě)能離(lí)到管壁上；降速過快(kuài)，可(kě)能導緻管底原生(shēng)質體(tǐ)懸起。建議(yì)升速和降速分(fēn)别都(dōu)使用3。
6. 原生(shēng)質體(tǐ)漂洗：
加入500 μl 轉化終止溶液輕輕重懸原生(shēng)質體(tǐ)，常溫100g離(lí)心1 min，盡量去(qù)除殘留的上清。
注：本步驟可(kě)以充分(fēn)去(qù)除殘留的轉化試劑溶液中的組分(fēn)，避免轉化試劑溶液中的組分(fēn)對于後續的不良影(yǐng)響。
7. 原生(shēng)質體(tǐ)重懸：
沉澱中加入1
ml培養溶液，輕柔重懸。
8. 原生(shēng)質體(tǐ)培養：
将離(lí)心管水平放(fàng)置，23-25oC弱光(guāng)培養。
注：根據實驗需求确定孵育時間。RNA分(fēn)析孵育2-6小時；酶活性分(fēn)析和蛋白(bái)标記實驗孵育2-16小時；基因編輯的效果在轉化24小時後可(kě)能被檢測到。
使用植物原生(shēng)質體(tǐ)轉化試劑盒轉化拟南(nán)芥原生(shēng)質體(tǐ)的效果圖。
實驗步驟：稱取0.48
g轉化試劑于2 ml 離(lí)心管中，加入轉化試劑溶解液後，颠倒混勻，蒸餾水定容至2 ml，使轉化試劑充分(fēn)溶解後備用。在2 ml的圓底離(lí)心管中加入10 μl（20 μg）EGFP質粒
(植物用綠色熒光(guāng)蛋白(bái))，加入100 μl制備好的原生(shēng)質體(tǐ)，輕柔混勻後加入110 μl當日(rì)配制好的轉化試劑溶液，輕柔混勻，常溫靜(jìng)置5
min後加入440 μl轉化終止溶液終止轉化，輕輕颠倒混勻，常溫100 g離(lí)心1
min，去(qù)除上清，再加入0.5 ml 轉化終止溶液，輕柔重懸原生(shēng)質體(tǐ)，常溫100
g離(lí)心1 min後，盡量去(qù)除上清，收集原生(shēng)質體(tǐ)。加入1 ml培養溶液，小心重懸原生(shēng)質體(tǐ)後水平放(fàng)置25℃培養過夜(約16h)，次日(rì)于熒光(guāng)顯微鏡下檢測EGFP熒光(guāng)信号。
植物原生(shēng)質體(tǐ)提取試劑盒發表文章(zhāng)列表
1. [IF=3.19] TaEXPB7-B,a
-expansin gene involved in low-temperature stress and abscisic acid
responses, promotes growth and cold resistance in Arabidopsis thaliana.
實驗植物：小麥
Author: Xu Feng, Yongqing Xu, Lina
Peng, Xingyu Yu, Qiaoqin Zhao, Shanshan Feng, Ziyi Zhao, Fenglan Li,
Baozhong Hu.
Journal: J Plant Physiology 2019
Institution： College
of Life Sciences, Northeast Agricultural University
Paper link：http://www.plantphysiol.org/content/174/4/2487
2. [IF=5.36] Involvement of the
chloroplast gene ferredoxin 1 in multiple responses of Nicotiana benthamiana to
Potato virus X infection.
實驗植物：煙草
Author: Xue Yang, Yuwen Lu, Fang Wang,
Ying Chen, Yanzhen Tian, Liangliang Jiang, Jiejun Peng, Hongying Zheng,
Lin Lin, Chengqi Yan, Michael Taliansky, Stuart MacFarlane, Yuanhua Wu,
Jianping Chen and Fei Yan
Journal: Journal of Experimental
Botany, 2020，Vol.71,
No. 6,2142–2156,
Institution：Institute
of Plant Virology, Ningbo University
Paper link：https://academic.oup.com/jxb/article/71/6/2142/5686178?login=true
3. [IF=7.228] Turnip mosaic
virus impairs perinuclear chloroplast clustering to facilitate viral infection
實驗植物：煙草
Author:Yushan Zhai, Quan Yuan, Shiyou Qiu,
Saisai Li, Miaomiao Li, Hongying Zheng, Guanwei Wu, Yuwen Lu, Jiejun Peng,
Shaofei Rao, Jianping Chen, Fei Yan
Journal: Plant Cell Enviroment, 2021，30
July
Institution：Institute
of Plant Virology, Ningbo University
Paper link：https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/pce.14157
4. [IF=5.64] A Novel, Small
Cysteine-Rich Effector, RsSCR10 in Rhizoctonia solani Is Sufficient to Trigger
Plant Cell Death
實驗植物：水稻
Author:Xianyu Niu, Guijing Yang, Hui Lin,
Yao Liu, Ping Li and Aiping Zheng
Journal: Fronties in Microbiology August
2021 | Volume 12 | Article 684923
Institution：Sichuan
Agricultural University
Paper link：https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fmicb.2021.684923/full
5. [IF=9.8] Synthesis of
flavour-related linalool is regulated by PpbHLH1 and associated with changes in
DNA methylation during peach fruit ripening
實驗植物：煙草
Author: Chunyan Wei, Hongru Liu,
Xiangmei Cao, Minglei Zhang, Xian Li, Kunsong Chen and Bo Zhang
Journal: Plant Biotechnology
Journal (2021) 19, pp. 2082–2096
Institution：Laboratory
of Fruit Quality Biology/Zhejiang Provincial Key Laboratory of Horticultural
Plant Integrative Biology, Zhejiang University
Paper link：https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/pbi.13638
6. [2020IF=1.04] EoPHR2, a
Phosphate Starvation Response Transcription Factor, Is Involved in Improving
Low-Phosphorus Stress Resistance in Eremochloa ophiuroides
實驗植物：拟南(nán)芥
Author: Ying Chen1,#, Chuanqiang
Liu1,#, Qingqing He1, Jianjian Li2, Jingjing Wang2, Ling Li2, Xiang Yao2,
Shenghao Zhou3, Haoran Wang
Journal: Phyton Vol.91, No.3, 2022,
pp.651-665
Institution： Institute
of Botany, Jiangsu Province and Chinese Academy of Sciences
Paper link：https://www.techscience.com/phyton/v91n3/45309
7. [2021IF=3.2] Establishment
and optimization of PEG-mediated protoplast transformation in the microalga Haematococcus
pluvia
實驗材料：雨(yǔ)生(shēng)紅(hóng)球藻 Haematococcus
pluvia
Author: Chunli Guo，Muhammad
Anwar， Rui Mei，Xinyi
Li， Di Zhao，Yanan
Jiang， Jieyi
Zhuang， Chen Liu，Chaogang
Wang， Zhangli
Hu
Journal: Journal of Applied
Phycology. Published
online 07 March 2022
Institution：College
of Optoelectronic Engineering, Shenzhen University
Paper link： https://link.springer.com/article/10.1007/s10811-022-02718-x
8. [2021 IF=5.9] The Genome-Wide
Identification of Long Non-Coding RNAs Involved in Floral Thermogenesis in
Nelumbo nucifera Gaertn
實驗材料：睡蓮 Nelumbo nucifera Gaertn
Author: Jing Jin , Yu Zou, Ying Wang,
Yueyang Sun, Jing Peng and Yi Ding
Journal: Int. J. Mol. Sci. 2022, 23, 4901.
Institution：College
of Life Sciences, Guizhou University，College
of Life Sciences, Wuhan University
Paper link： https://www.mdpi.com/1422-0067/23/9/4901
9. [2021 IF=17.9] Genome-wide association
analysis reveals a novel pathway mediated by a dual-TIR
domainprotein for pathogen resistance in cotton
實驗材料：棉花
Author: Yihao Zhang, Yaning Zhang,
Xiaoyang Ge, Yuan Yuan, Yuying Jin, Ye Wang, Lihong Zhao, Xiao Han, Wei Hu, Lan
Yang, Chenxu Gao, Xi Wei, Fuguang Li, Zhaoen Yang
Journal: Genome Biology (2023) 24:111
Institution：Institute
of Cotton Research, Chinese Academy of Agricultura Sciences
Paper link： https://doi.org/10.1186/s13059-023-02950-9
10.
[2022 IF=7.4] Rose long noncoding RNA lncWD83 promotes flowerin by modulating
ubiquitination of the floral repressor RcMYC2L
實驗材料：Rose 玫瑰
Author: Chen Yeqing ,Lu Jun ,Wang Weinan ,Fan Chunguo ,Yuan Guozhen ,Sun Jingjing ,Liu
Jinyi ,Wang Changquan
Journal: Plant Physiol (2023) Published: 19 September 2023
Institution：College of Horticulture, Nanjing
Agricultural University
Paper link： https://doi.org/10.1093/plphys/kiad502