植物葉綠體(tǐ)提取試劑盒
産品編号
|
産品名稱
|
包裝
|
RTU5001
|
植物葉綠體(tǐ)提取試劑盒
|
10次
|
● 産品簡介:
葉綠體(tǐ)(Chloroplast)是質體(tǐ)的一種, 是高等植物和一些藻類所特有的能量轉換器,是光(guāng)合作(zuò)用的反應場所。在高等植物中葉綠體(tǐ)爲雙凸或平凸透鏡,長徑5~10μm,短(duǎn)徑2~4μm,厚2~3μm。高等植物的葉肉細胞一般含50~200個葉綠體(tǐ),可(kě)占細胞質的40%,葉綠體(tǐ)的數目因物種細胞類型,生(shēng)态環境,生(shēng)理(lǐ)狀态而有所不同。葉綠體(tǐ)由葉綠體(tǐ)外被(chloroplast envelope)、類囊體(tǐ)(thylakoid)和基質(stroma)三部分(fēn)組成,含有3種不同的膜:外膜、内膜、類囊體(tǐ)膜和3種彼此分(fēn)開的腔:膜間隙、基質和類囊體(tǐ)腔。本公司的植物葉綠體(tǐ)提取試劑盒采用密度梯度離(lí)心方法,可(kě)以從(cóng)多種植物中提取高純度的葉綠體(tǐ)。
1.
即用型試劑盒,用戶不需要單獨配制各種溶液。
2.
試劑盒可(kě)以用于葉綠體(tǐ)粗提,所得(de)葉綠體(tǐ)含少量其他(tā)細胞器污染,可(kě)用于後續的SDS-PAGE,Western,ELSIA和蛋白(bái)組分(fēn)析。也可(kě)以用于葉綠體(tǐ)精提,所得(de)葉綠體(tǐ)完整,可(kě)用于後續的光(guāng)合作(zuò)用,電子鏈和磷酸化,跨膜轉運,體(tǐ)外葉綠體(tǐ)蛋白(bái)合成,蛋白(bái)定位等研究。還(hái)可(kě)用于葉綠體(tǐ)膜,基質,類囊體(tǐ)的提取以及葉綠體(tǐ)DNA和葉綠體(tǐ)RNA純化。
3.
以每次處理(lǐ)30
g葉片計(jì)算,本産品可(kě)使用8-10次提取,每次能得(de)到3-5
mg左右葉綠體(tǐ)。
4.
已經成功用于拟南(nán)芥,綠蘿,菠菜,大(dà)豆,莴筍,白(bái)菜,煙草和甜菜等植物,還(hái)可(kě)用于更多植物(可(kě)能需要優化條件(jiàn))。
● 貯存及運輸:
4-8℃保存,至少一年(nián)有效;試劑盒常溫運輸。
● 産品組成:
産品貨号
|
産品名稱
|
包裝
|
貯存
|
RTU5001-01
|
葉綠體(tǐ)提取緩沖液(5×)
|
2×250
ml
|
4-8℃
|
RTU5001-02
|
密度梯度分(fēn)離(lí)試劑
|
65
ml
|
4-8℃
|
RTU5001-03
|
BSA
|
3
g
|
4-8℃
|
RTU5001-04
|
1
M DTT(粉末裝)
|
2.5
ml
|
4-8℃
配制後-20℃貯存
|
RTU5001-05
|
過濾紙
|
50張/包
|
RT
|
|
說(shuō)明書(shū)
|
一份
|
-
|
● 使用說(shuō)明:
注意:葉綠體(tǐ)對溫度高度敏感,所以整個操作(zuò)必須在冰上或者在冷(lěng)室進行,所用器皿和溶液均需要在4℃預冷(lěng)。離(lí)心時一定要在4℃進行,離(lí)心力以g而不是rpm計(jì)算。如(rú)果需要研究葉綠體(tǐ)的功能,提取過程還(hái)需要在昏暗的光(guāng)線條件(jiàn)下進行。
需要自(zì)備材料:
剪刀;50
ml尖底或圓底離(lí)心管;15
ml尖底或圓底離(lí)心管;漏鬥;勻漿機(jī);低溫離(lí)心機(jī)。
1.1 材料預處理(lǐ):
實驗前1-2天将植物放(fàng)在暗室培養以減少葉綠體(tǐ)中澱粉顆粒的形成,否則離(lí)心時這些顆粒很容易使葉綠體(tǐ)破裂。葉片在實驗前需先用自(zì)來(lái)水洗淨,再用蒸餾水淋洗,去(qù)掉多餘水分(fēn)。如(rú)果葉片采集後不能立即處理(lǐ),則保存時需要保持葉片濕潤,即使如(rú)此,葉片采集後的放(fàng)置時間也不能超過一天。
1.2
1×葉綠體(tǐ)提取緩沖液(即用型)配制:
|
1×葉綠體(tǐ)提取緩沖液(即用型)
配制量200 ml
|
葉綠體(tǐ)提取緩沖液(5×)
|
40 ml
|
BSA
|
0.2 g
|
1 M DTT
|
200 μl
|
滅菌水
|
定容至200 ml
|
|
冰上預冷(lěng)待用,現用現配,不建議(yì)貯存
|
注:一個30克樣品提取反應需要 150 ml 1×葉綠體(tǐ)提取緩沖液(即用型)。
1.3 葉片勻漿:
1.3.1 新鮮采集植物葉片,快(kuài)速去(qù)除葉脈(約30克)并将葉片剪成1-3 cm2大(dà)小的碎片并浸泡在150 ml的預冷(lěng)的1×葉綠體(tǐ)提取緩沖液(即用型)中(每克葉片加5 ml)。
1.3.2 将浸泡了葉片的溶液轉移到勻漿機(jī)(貨号:RT-2243A)中,低速勻漿10秒,避免起泡沫。用玻璃棒把液面的碎片按入勻漿機(jī)底部後,再低速勻漿10秒,重複10秒勻漿3-4次至葉片破碎即可(kě),不要過分(fēn)勻漿,否則會降低完整葉綠體(tǐ)的得(de)率。
1.3.3 用2層過濾紙置于小漏鬥上,将勻漿液過濾收集到預冷(lěng)的250 ml量筒中,一般更換三次濾紙可(kě)收集約120 ml濾液,将濾液等分(fēn)到4個預冷(lěng)的50 ml的塑料離(lí)心管中(每個管中的濾液不要超過35 ml)。
1.4 離(lí)心去(qù)雜質:
4℃ 200 g離(lí)心5分(fēn)鍾,沉澱爲未破裂植物組織、細胞或細胞核,如(rú)果樣品中澱粉含量較高,沉澱可(kě)能爲白(bái)色。(右圖)
注:此步驟用低速離(lí)心去(qù)除雜質,不能省略,否則提取的葉綠體(tǐ)會有其他(tā)細胞器的污染。
1.5 收集葉綠體(tǐ)粗提液:
1.5.1将步驟1.4得(de)到的上清液平分(fēn)到4個預冷(lěng)的50 ml塑料離(lí)心管中。
1.5.2 4℃ 1100 g離(lí)心15分(fēn)鍾,小心棄上清,沉澱含葉綠體(tǐ),呈深綠色(右圖)。
1.5.3 在沉澱中加入1.5 ml 預冷(lěng)的1×葉綠體(tǐ)提取緩沖液(即用型),手彈離(lí)心管底部使葉綠體(tǐ)重懸,收集4管溶液(約6 ml),此溶液即爲葉綠體(tǐ)粗提産物(含有破碎的葉綠體(tǐ)和完整的葉綠體(tǐ)),可(kě)直接用于後續的SDS-PAGE,Western,蛋白(bái)組分(fēn)析。
注:重懸時最好避免溶液起泡,手指輕彈,不要用槍頭吹打,否則葉綠體(tǐ)容易破裂。
1.6 完整葉綠體(tǐ)的純化:
葉綠體(tǐ)重懸液配制
|
葉綠體(tǐ)重懸液
|
|
配制量20 ml
|
葉綠體(tǐ)提取緩沖液(5×)
|
4 ml
|
滅菌水
|
16 ml
|
|
冰上預冷(lěng)待用,現用現配,不建議(yì)貯存
|
1.6.1 單梯度分(fēn)離(lí)法(适合菠菜,白(bái)菜,莴苣,拟南(nán)芥,綠蘿等):
1.6.1.1 40%密度梯度液配制-10 ml:
在15 ml離(lí)心管中加入6 ml 1×葉綠體(tǐ)提取緩沖液(即用型)和4 ml密度梯度分(fēn)離(lí)試劑,充分(fēn)混合均勻,得(de)40%密度梯度液,冰浴備用。
1.6.1.2将10 ml 40%密度梯度液平分(fēn)到2個 15 ml離(lí)心管中,每管5 ml;将步驟1.5.3得(de)到的葉綠體(tǐ)粗提液3 ml小心鋪在5 ml密度梯度液之上;另一管重複。(5 ml 40%密度梯度液用可(kě)以分(fēn)離(lí)3 ml 葉綠體(tǐ)粗提液,其他(tā)體(tǐ)積以此比例換算)。
1.6.1.3 4℃ 3200 g離(lí)心15分(fēn)鍾,綠色沉澱爲完整葉綠體(tǐ)(右圖)。
注:如(rú)果最上層的分(fēn)離(lí)試劑不夠清亮,可(kě)以延長離(lí)心20分(fēn)鍾。
1.6.1.4 小心棄上清,保留沉澱,每管沉澱中加入1 ml 葉綠體(tǐ)重懸液,輕柔重懸,可(kě)以收集到2 ml完整葉綠體(tǐ)溶液。
1.6.2雙梯度分(fēn)離(lí)法(适合煙草,甜菜,豌豆等):
1.6.2.1 80%密度梯度重液配制-4 ml:
在15 ml離(lí)心管中加入0.8 ml 1×葉綠體(tǐ)提取緩沖液(即用型)和3.2 ml 密度梯度分(fēn)離(lí)試劑,充分(fēn)混合均勻,得(de)80%密度梯度重液。
1.6.2.2 40%密度梯度輕液配制-8 ml:
在另一15 ml離(lí)心管加入4.8 ml 1×葉綠體(tǐ)提取緩沖液(即用型)和3.2 ml 密度梯度分(fēn)離(lí)試劑,充分(fēn)混合均勻,得(de)40%密度梯度輕液。
1.6.2.3 取一隻15 ml離(lí)心管,加入1.86 ml 80%密度梯度重液,随後取3.74 ml 40%密度梯度輕液小心鋪在80%密度梯度重液之上,冰浴備用;然後取步驟1.5.3得(de)到的3 ml葉綠體(tǐ)粗提液小心鋪在密度梯度輕液之上。另一管重複。
注:每5.6 ml
40%/80%密度梯度液可(kě)以分(fēn)離(lí)3 ml 葉綠體(tǐ)粗提液;其他(tā)體(tǐ)積按照(zhào)比例調整。
1.6.2.4 4℃ 3200 g離(lí)心15分(fēn)鍾,上層綠色帶含破碎的葉綠體(tǐ)、線粒體(tǐ)和核糖體(tǐ)等,重液和輕液間的綠色帶爲完整葉綠體(tǐ)(右圖)。
注:如(rú)果最上層的分(fēn)離(lí)試劑不夠清亮,可(kě)以延長離(lí)心20分(fēn)鍾。
1.6.2.5 重懸葉綠體(tǐ):
用廣口吸管小心将重液和輕液之間的綠色帶(完整葉綠體(tǐ))轉移到新的15 ml離(lí)心管中,加入三倍體(tǐ)積預冷(lěng)的葉綠體(tǐ)重懸液,輕柔混勻。
1.6.2.6 離(lí)心收集葉綠體(tǐ):
4℃ 1750 g離(lí)心6分(fēn)鍾,小心将上清倒出後,在綠色的葉綠體(tǐ)沉澱中加入預冷(lěng)的0.5 ml葉綠體(tǐ)重懸液,手指輕彈管底使葉綠體(tǐ)重懸。最終可(kě)以收集到1
ml完整葉綠體(tǐ)溶液。
1.7 葉綠體(tǐ)貯存:
葉綠體(tǐ)可(kě)在顯微鏡下檢查葉綠體(tǐ)完整性。葉綠體(tǐ)重懸液避光(guāng)-80℃保存。葉綠體(tǐ)必須盡快(kuài)使用,否則非常容易失去(qù)活性。所得(de)精提葉綠體(tǐ)可(kě)用于後續的光(guāng)合作(zuò)用,電子鏈和磷酸化,跨膜轉運,體(tǐ)外葉綠體(tǐ)蛋白(bái)合成,蛋白(bái)定位等研究。還(hái)可(kě)用于葉綠體(tǐ)膜,基質,類囊體(tǐ)提取以及葉綠體(tǐ)DNA和葉綠體(tǐ)RNA純化實驗等。
1.8 葉綠素含量測定:
通常葉綠體(tǐ)含量用單位葉綠素含量來(lái)表示,即x
mg 葉綠素/ml 葉綠體(tǐ)懸浮液。
1.8.1
取10 μl 葉綠體(tǐ)懸浮液加入到990
μl 80%丙酮溶液中,混勻。
1.8.2
3000 g 離(lí)心5分(fēn)鍾,取上清測定OD652 吸光(guāng)值,用80%丙酮做空白(bái)對照(zhào)。
1.8.3
根據以下公式計(jì)算葉綠素:
葉綠素濃度(mg/ml)=(OD652×100)/36
100:稀釋倍數
1.9 實驗示例:
30克綠蘿葉片,加入150
ml 1×葉綠體(tǐ)提取緩沖液(即用型)勻漿5×10秒,3次過濾共收集120
ml過濾液,平分(fēn)4管,4℃ 1100
g 離(lí)心15 min,棄上清,每管重懸于1.5
ml 1×葉綠體(tǐ)提取緩沖液(即用型)中,共得(de)到6
ml 葉綠體(tǐ)粗提液。2×3
ml 粗提液平鋪于2×5
ml 40%密度梯度液之上,4℃ 3200 g離(lí)心15分(fēn)鍾,棄上清,每管沉澱重懸于1 ml 葉綠體(tǐ)重懸液中,共得(de)到2 ml精制葉綠體(tǐ)重懸液,測定葉綠素含量爲3.43 mg/ml重懸液。30克葉片提取得(de)到6.86 mg葉綠體(tǐ)。取10
μl葉綠體(tǐ)溶液稀釋20倍,取50 μl稀釋液顯微鏡40倍物鏡觀察,如(rú)右圖。
RTU5001 植物葉綠體(tǐ)提取試劑盒發表文章(zhāng)列表
1. [2022 IF=7.2] Sufficient potassium improves
inorganic phosphate-limited photosynthesis in Brassica napus by enhancing
metabolic P fractions and Rubisco activity.
實驗植物:油菜
Author: Jinyao Yan, Xiaolei Ye, Yi Song,
Tao Ren, Chongming Wang, Xiaokun Li, Rihuan Cong, Zhifeng Lu,Jianwei Lu.
Journal: The Plant Journal (2023) 113, 416–429
Institution: Huazhong
Agricultural University
Paper link: https://doi.org/10.1111/tpj.16057