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植物葉綠體(tǐ)提取試劑盒(大(dà)量樣品)

植物葉綠體(tǐ)提取試劑盒(大(dà)量樣品)

産品編号:RTU5001

産品規格:10次

數量
價格 ¥800


植物葉綠體(tǐ)提取試劑盒        

産品編号

産品名稱

包裝

RTU5001

植物葉綠體(tǐ)提取試劑盒

10

産品簡介:

葉綠體(tǐ)(Chloroplast)是質體(tǐ)的一種, 是高等植物和一些藻類所特有的能量轉換器,是光(guāng)合作(zuò)用的反應場所。在高等植物中葉綠體(tǐ)爲雙凸或平凸透鏡,長徑5~10μm,短(duǎn)徑2~4μm,厚2~3μm。高等植物的葉肉細胞一般含50~200個葉綠體(tǐ),可(kě)占細胞質的40%,葉綠體(tǐ)的數目因物種細胞類型,生(shēng)态環境,生(shēng)理(lǐ)狀态而有所不同。葉綠體(tǐ)由葉綠體(tǐ)外被(chloroplast envelope)、類囊體(tǐ)(thylakoid)和基質(stroma)三部分(fēn)組成,含有3種不同的膜:外膜、内膜、類囊體(tǐ)膜和3種彼此分(fēn)開的腔:膜間隙、基質和類囊體(tǐ)腔。本公司的植物葉綠體(tǐ)提取試劑盒采用密度梯度離(lí)心方法,可(kě)以從(cóng)多種植物中提取高純度的葉綠體(tǐ)。

1. 即用型試劑盒,用戶不需要單獨配制各種溶液。

2. 試劑盒可(kě)以用于葉綠體(tǐ)粗提,所得(de)葉綠體(tǐ)含少量其他(tā)細胞器污染,可(kě)用于後續的SDS-PAGE,Western,ELSIA和蛋白(bái)組分(fēn)析。也可(kě)以用于葉綠體(tǐ)精提,所得(de)葉綠體(tǐ)完整,可(kě)用于後續的光(guāng)合作(zuò)用,電子鏈和磷酸化,跨膜轉運,體(tǐ)外葉綠體(tǐ)蛋白(bái)合成,蛋白(bái)定位等研究。還(hái)可(kě)用于葉綠體(tǐ)膜,基質,類囊體(tǐ)的提取以及葉綠體(tǐ)DNA和葉綠體(tǐ)RNA純化。

3. 以每次處理(lǐ)30 g葉片計(jì)算,本産品可(kě)使用8-10次提取,每次能得(de)到3-5 mg左右葉綠體(tǐ)。

4. 已經成功用于拟南(nán)芥,綠蘿,菠菜,大(dà)豆,莴筍,白(bái)菜,煙草和甜菜等植物,還(hái)可(kě)用于更多植物(可(kě)能需要優化條件(jiàn))。

貯存及運輸:

4-8℃保存,至少一年(nián)有效;試劑盒常溫運輸。

産品組成:

産品貨号

産品名稱

包裝

貯存

RTU5001-01

葉綠體(tǐ)提取緩沖液(

2×250 ml

4-8

RTU5001-02

密度梯度分(fēn)離(lí)試劑

65 ml

4-8

RTU5001-03

BSA

3 g

4-8

RTU5001-04

1 M DTT(粉末裝)

2.5 ml

4-8

配制後-20℃貯存

RTU5001-05

過濾紙

50/

RT

 

說(shuō)明書(shū)

一份

-

使用說(shuō)明:

注意:葉綠體(tǐ)對溫度高度敏感,所以整個操作(zuò)必須在冰上或者在冷(lěng)室進行,所用器皿和溶液均需要在4℃預冷(lěng)。離(lí)心時一定要在4℃進行,離(lí)心力以g而不是rpm計(jì)算。如(rú)果需要研究葉綠體(tǐ)的功能,提取過程還(hái)需要在昏暗的光(guāng)線條件(jiàn)下進行。

需要自(zì)備材料:

剪刀;50 ml尖底或圓底離(lí)心管;15 ml尖底或圓底離(lí)心管;漏鬥;勻漿機(jī);低溫離(lí)心機(jī)。

1.1 材料預處理(lǐ):

實驗前1-2天将植物放(fàng)在暗室培養以減少葉綠體(tǐ)中澱粉顆粒的形成,否則離(lí)心時這些顆粒很容易使葉綠體(tǐ)破裂。葉片在實驗前需先用自(zì)來(lái)水洗淨,再用蒸餾水淋洗,去(qù)掉多餘水分(fēn)。如(rú)果葉片采集後不能立即處理(lǐ),則保存時需要保持葉片濕潤,即使如(rú)此,葉片采集後的放(fàng)置時間也不能超過一天。

1.2  1×葉綠體(tǐ)提取緩沖液(即用型)配制:

 

葉綠體(tǐ)提取緩沖液(即用型)

配制量200 ml

葉綠體(tǐ)提取緩沖液(

40 ml

BSA

0.2 g

1 M DTT

200 μl

滅菌水

定容至200 ml

 

冰上預冷(lěng)待用,現用現配,不建議(yì)貯存

注:一個30克樣品提取反應需要 150 ml 1×葉綠體(tǐ)提取緩沖液(即用型)。

1.3 葉片勻漿:

1.3.1 新鮮采集植物葉片,快(kuài)速去(qù)除葉脈(約30克)并将葉片剪成1-3 cm2大(dà)小的碎片并浸泡在150 ml的預冷(lěng)的1×葉綠體(tǐ)提取緩沖液(即用型)中(每克葉片加5 ml)。

1.3.2 将浸泡了葉片的溶液轉移到勻漿機(jī)(貨号:RT-2243A)中,低速勻漿10秒,避免起泡沫。用玻璃棒把液面的碎片按入勻漿機(jī)底部後,再低速勻漿10秒,重複10秒勻漿3-4次至葉片破碎即可(kě),不要過分(fēn)勻漿,否則會降低完整葉綠體(tǐ)的得(de)率。

1.3.3 2層過濾紙置于小漏鬥上,将勻漿液過濾收集到預冷(lěng)的250 ml量筒中,一般更換三次濾紙可(kě)收集約120 ml濾液,将濾液等分(fēn)到4個預冷(lěng)的50 ml的塑料離(lí)心管中(每個管中的濾液不要超過35 ml)。

1.4  離(lí)心去(qù)雜質:

4 200 g離(lí)心5分(fēn)鍾,沉澱爲未破裂植物組織、細胞或細胞核,如(rú)果樣品中澱粉含量較高,沉澱可(kě)能爲白(bái)色。(右圖)

注:此步驟用低速離(lí)心去(qù)除雜質,不能省略,否則提取的葉綠體(tǐ)會有其他(tā)細胞器的污染。

1.5 收集葉綠體(tǐ)粗提液:

1.5.1将步驟1.4得(de)到的上清液平分(fēn)到4個預冷(lěng)的50 ml塑料離(lí)心管中。

1.5.2 4 1100 g離(lí)心15分(fēn)鍾,小心棄上清,沉澱含葉綠體(tǐ),呈深綠色(右圖)。

1.5.3 在沉澱中加入1.5 ml 預冷(lěng)的1×葉綠體(tǐ)提取緩沖液(即用型),手彈離(lí)心管底部使葉綠體(tǐ)重懸,收集4管溶液(約6 ml),此溶液即爲葉綠體(tǐ)粗提産物(含有破碎的葉綠體(tǐ)和完整的葉綠體(tǐ)),可(kě)直接用于後續的SDS-PAGEWestern,蛋白(bái)組分(fēn)析。

注:重懸時最好避免溶液起泡,手指輕彈,不要用槍頭吹打,否則葉綠體(tǐ)容易破裂。

1.6 完整葉綠體(tǐ)的純化:

葉綠體(tǐ)重懸液配制

 

葉綠體(tǐ)重懸液

 

配制量20 ml

葉綠體(tǐ)提取緩沖液(

4 ml

滅菌水

16 ml

 

冰上預冷(lěng)待用,現用現配,不建議(yì)貯存

1.6.1 單梯度分(fēn)離(lí)法(适合菠菜,白(bái)菜,莴苣,拟南(nán)芥,綠蘿等):

1.6.1.1 40%密度梯度液配制-10 ml

15 ml離(lí)心管中加入6 ml 1×葉綠體(tǐ)提取緩沖液(即用型)和4 ml密度梯度分(fēn)離(lí)試劑,充分(fēn)混合均勻,得(de)40%密度梯度液,冰浴備用。

1.6.1.210 ml 40%密度梯度液平分(fēn)到2 15 ml離(lí)心管中,每管5 ml;将步驟1.5.3得(de)到的葉綠體(tǐ)粗提液3 ml小心鋪在5 ml密度梯度液之上;另一管重複。(5 ml 40%密度梯度液用可(kě)以分(fēn)離(lí)3 ml 葉綠體(tǐ)粗提液,其他(tā)體(tǐ)積以此比例換算)。

1.6.1.3  43200 g離(lí)心15分(fēn)鍾,綠色沉澱爲完整葉綠體(tǐ)(右圖)。

注:如(rú)果最上層的分(fēn)離(lí)試劑不夠清亮,可(kě)以延長離(lí)心20分(fēn)鍾。

1.6.1.4 小心棄上清,保留沉澱,每管沉澱中加入1 ml 葉綠體(tǐ)重懸液,輕柔重懸,可(kě)以收集到2 ml完整葉綠體(tǐ)溶液。

1.6.2雙梯度分(fēn)離(lí)法(适合煙草,甜菜,豌豆等):

1.6.2.1 80%密度梯度重液配制-4 ml

15 ml離(lí)心管中加入0.8 ml 1×葉綠體(tǐ)提取緩沖液(即用型)和3.2 ml 密度梯度分(fēn)離(lí)試劑,充分(fēn)混合均勻,得(de)80%密度梯度重液。

1.6.2.2 40%密度梯度輕液配制-8 ml

在另一15 ml離(lí)心管加入4.8 ml 1×葉綠體(tǐ)提取緩沖液(即用型)和3.2 ml 密度梯度分(fēn)離(lí)試劑,充分(fēn)混合均勻,得(de)40%密度梯度輕液。

1.6.2.3 取一隻15 ml離(lí)心管,加入1.86 ml 80%密度梯度重液,随後取3.74 ml 40%密度梯度輕液小心鋪在80%密度梯度重液之上,冰浴備用;然後取步驟1.5.3得(de)到的3 ml葉綠體(tǐ)粗提液小心鋪在密度梯度輕液之上。另一管重複。

注:每5.6 ml 40%/80%密度梯度液可(kě)以分(fēn)離(lí)3 ml 葉綠體(tǐ)粗提液;其他(tā)體(tǐ)積按照(zhào)比例調整。

1.6.2.4 4 3200 g離(lí)心15分(fēn)鍾,上層綠色帶含破碎的葉綠體(tǐ)、線粒體(tǐ)和核糖體(tǐ)等,重液和輕液間的綠色帶爲完整葉綠體(tǐ)(右圖)。

注:如(rú)果最上層的分(fēn)離(lí)試劑不夠清亮,可(kě)以延長離(lí)心20分(fēn)鍾。

1.6.2.5 重懸葉綠體(tǐ):

用廣口吸管小心将重液和輕液之間的綠色帶(完整葉綠體(tǐ))轉移到新的15 ml離(lí)心管中,加入三倍體(tǐ)積預冷(lěng)的葉綠體(tǐ)重懸液,輕柔混勻。

1.6.2.6 離(lí)心收集葉綠體(tǐ):

4 1750 g離(lí)心6分(fēn)鍾,小心将上清倒出後,在綠色的葉綠體(tǐ)沉澱中加入預冷(lěng)的0.5 ml葉綠體(tǐ)重懸液,手指輕彈管底使葉綠體(tǐ)重懸。最終可(kě)以收集到1 ml完整葉綠體(tǐ)溶液。

1.7 葉綠體(tǐ)貯存:

葉綠體(tǐ)可(kě)在顯微鏡下檢查葉綠體(tǐ)完整性。葉綠體(tǐ)重懸液避光(guāng)-80℃保存。葉綠體(tǐ)必須盡快(kuài)使用,否則非常容易失去(qù)活性。所得(de)精提葉綠體(tǐ)可(kě)用于後續的光(guāng)合作(zuò)用,電子鏈和磷酸化,跨膜轉運,體(tǐ)外葉綠體(tǐ)蛋白(bái)合成,蛋白(bái)定位等研究。還(hái)可(kě)用于葉綠體(tǐ)膜,基質,類囊體(tǐ)提取以及葉綠體(tǐ)DNA和葉綠體(tǐ)RNA純化實驗等。

1.8 葉綠素含量測定:

通常葉綠體(tǐ)含量用單位葉綠素含量來(lái)表示,即x mg 葉綠素/ml 葉綠體(tǐ)懸浮液。

1.8.1 取10 μl 葉綠體(tǐ)懸浮液加入到990 μl 80%丙酮溶液中,混勻。

1.8.2 3000 g 離(lí)心5分(fēn)鍾,取上清測定OD652 吸光(guāng)值,用80%丙酮做空白(bái)對照(zhào)。

1.8.3 根據以下公式計(jì)算葉綠素:

葉綠素濃度(mg/ml)=(OD652×100)/36

100:稀釋倍數

36:extinction coefficient in ml/cm·mg

1.9 實驗示例:

30克綠蘿葉片,加入150 ml 1×葉綠體(tǐ)提取緩沖液(即用型)勻漿5×10秒,3次過濾共收集120 ml過濾液,平分(fēn)4管,4℃ 1100 g 離(lí)心15 min,棄上清,每管重懸于1.5 ml 1×葉綠體(tǐ)提取緩沖液(即用型)中,共得(de)到6 ml 葉綠體(tǐ)粗提液。2×3 ml 粗提液平鋪于2×5 ml 40%密度梯度液之上,4 3200 g離(lí)心15分(fēn)鍾,棄上清,每管沉澱重懸于1 ml 葉綠體(tǐ)重懸液中,共得(de)到2 ml精制葉綠體(tǐ)重懸液,測定葉綠素含量爲3.43 mg/ml重懸液。30克葉片提取得(de)到6.86 mg葉綠體(tǐ)。取10 μl葉綠體(tǐ)溶液稀釋20倍,取50 μl稀釋液顯微鏡40倍物鏡觀察,如(rú)右圖。


RTU5001 植物葉綠體(tǐ)提取試劑盒發表文章(zhāng)列表

1. [2022 IF=7.2] Sufficient potassium improves inorganic phosphate-limited photosynthesis in Brassica napus by enhancing metabolic P fractions and Rubisco activity.

實驗植物:油菜

Author: Jinyao Yan, Xiaolei Ye, Yi Song, Tao Ren, Chongming Wang, Xiaokun Li, Rihuan Cong, Zhifeng Lu,Jianwei Lu.

Journal: The Plant Journal (2023) 113, 416–429

Institution  Huazhong Agricultural University

Paper link https://doi.org/10.1111/tpj.16057


 
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