植物類囊體(tǐ)膜提取試劑盒         Ver.731075

● 産品簡介：

葉綠體(tǐ)（Chloroplast）是質體(tǐ)的一種, 是高等植物和一些藻類所特有的能量轉換器，是光(guāng)合作(zuò)用的反應場所。在高等植物中葉綠體(tǐ)象雙凸或平凸透鏡，長徑5~10μm，短(duǎn)徑2~4μm，厚2~3μm。高等植物的葉肉細胞一般含50～200個葉綠體(tǐ)，可(kě)占細胞質的40%，葉綠體(tǐ)的數目因物種細胞類型，生(shēng)态環境，生(shēng)理(lǐ)狀态而有所不同。葉綠體(tǐ)由葉綠體(tǐ)被膜(chloroplast envelope)、類囊體(tǐ)(thylakoid)和基質(stroma)三部分(fēn)組成，含有3種不同的膜：外膜、内膜、類囊體(tǐ)膜和3種彼此分(fēn)開的腔：膜間隙、基質和類囊體(tǐ)腔。類囊體(tǐ)膜上含有光(guāng)合色素和電子傳遞鏈組分(fēn)，光(guāng)反應在此上進行，因此類囊體(tǐ)膜也稱光(guāng)合膜。

本公司的植物類囊體(tǐ)膜提取試劑盒采用差速離(lí)心方法，可(kě)以從(cóng)植物中提取到高純度的類囊體(tǐ)膜樣品。

1. 即用型試劑盒，用戶不需要單獨配制各種溶液。

2. 每次處理(lǐ)30 g葉片計(jì)算，本産品可(kě)使用8-10次提取，每次能得(de)到8-10 mg左右類囊體(tǐ)膜樣品。

3. 已經成功用于拟南(nán)芥，綠蘿，菠菜，豌豆，煙草等植物，還(hái)可(kě)用于更多植物（可(kě)能需要優化條件(jiàn)）。

● 貯存及運輸：

4-8℃保存，至少一年(nián)有效；試劑盒常溫運輸。

● 産品組成：

● 使用說(shuō)明：

注意：類囊體(tǐ)膜對溫度高度敏感，所以整個操作(zuò)必須在冰上或者在冷(lěng)室進行，所用器皿和

溶液均需要在4℃預冷(lěng)。離(lí)心時一定要在4℃進行，離(lí)心力以g而不是rpm計(jì)算。如(rú)果需要研究類囊體(tǐ)膜的功能，提取過程還(hái)需要在昏暗的光(guāng)線條件(jiàn)下進行。

需要自(zì)備材料：

剪刀；50 ml尖底或圓底離(lí)心管；15 ml尖底或圓底離(lí)心管；勻漿機(jī)；低溫離(lí)心機(jī)。

1.1 材料預處理(lǐ)：

葉片在實驗前需先用自(zì)來(lái)水洗淨，再用蒸餾水淋洗，去(qù)掉多餘水分(fēn)。如(rú)果葉片采集後不能立即處理(lǐ)，則保存時需要保持葉片濕潤，即使如(rú)此，葉片采集後的放(fàng)置時間也不能超過一天。

1.2  1×類囊體(tǐ)膜提取緩沖液（即用型）配制：

注：一個30克樣品提取反應需要 120 ml 1×類囊體(tǐ)膜提取緩沖液（即用型）。

1.3 葉片勻漿：

1.3.1 新鮮采集植物葉片（約30克），快(kuài)速去(qù)除葉脈并将葉片剪成1-3 cm²大(dà)小的碎片并浸泡在120 ml的預冷(lěng)的1×類囊體(tǐ)膜提取緩沖液（即用型）中（每克葉片加4 ml）。

1.3.2 将浸泡了葉片的溶液轉移到電動勻漿機(jī)（即家用制備果汁的勻漿機(jī)，可(kě)選貨号：RT-2243A）中，低速勻漿5秒，避免起泡沫。用玻璃棒把液面的碎片按入勻漿機(jī)底部後，再低速勻漿5秒。注意：除電動勻漿機(jī)外，還(hái)可(kě)以選擇玻璃勻漿器和研磨（加玻璃珠）等裂解細胞的方法，但(dàn)這些方法的單次處理(lǐ)量都(dōu)比較小，需要将樣品分(fēn)成很多小份單獨勻漿，然後再彙集。注：不要用液氮研磨，會損傷類囊體(tǐ)膜；不要過度勻漿，把葉片打碎即可(kě)，否則會降低類囊體(tǐ)膜得(de)率。

1.3.3過濾勻漿液：2層過濾紙放(fàng)于漏鬥上，用漏鬥将濾液收集到預冷(lěng)的250 ml量筒中，一般分(fēn)三次收集，總共可(kě)收集80-85 ml濾液，将濾液等分(fēn)到4個預冷(lěng)的50 ml的塑料離(lí)心管中（每個管中的濾液不要超過35 ml）。

1.4類囊體(tǐ)膜收集：

  4℃ 4200 g離(lí)心15分(fēn)鍾，小心棄上清，沉澱即爲類囊體(tǐ)膜。

1.5 類囊體(tǐ)膜漂洗：

1.5.1 在類囊體(tǐ)膜沉澱中加入1 ml 預冷(lěng)的類囊體(tǐ)膜漂洗液，手彈離(lí)心管底部使沉澱重懸；再補加1 ml預冷(lěng)的類囊體(tǐ)膜漂洗液，徹底重懸沉澱。

注：重懸時最好避免溶液起泡，手指輕彈，不要用槍頭吹打，否則容易損傷類囊體(tǐ)膜。

1.5.2  4度10000 g離(lí)心2分(fēn)鍾，棄上清，保留沉澱。

1.6 類囊體(tǐ)膜重懸：

1.6.1  沉澱中加入1 ml的類囊體(tǐ)膜溶解液，手彈離(lí)心管底部使沉澱重懸；再補加1 ml預冷(lěng)的類囊體(tǐ)膜溶解液，徹底重懸沉澱。

1.6.2  4℃10000 g離(lí)心2分(fēn)鍾，上清爲可(kě)溶性蛋白(bái)（根據實驗需要保留），沉澱爲類囊體(tǐ)膜組分(fēn)。

1.6.3 沉澱中加入1 ml類囊體(tǐ)膜溶解液，輕柔重懸沉澱，合并4管溶液，即爲最終得(de)到的類囊體(tǐ)膜溶液，約4 ml。

1.7 類囊體(tǐ)膜溶液定量：

通常類囊體(tǐ)膜蛋白(bái)含量用單位葉綠素含量來(lái)表示，即x μg 葉綠素/ml 類囊體(tǐ)膜溶液。

1.7.1 取5 μl 類囊體(tǐ)膜溶液加入到995 μl 80%丙酮溶液中，混勻。

1.7.2 10000 g 4℃離(lí)心2分(fēn)鍾，吸取上清，測定OD₆₆₃和OD₆₄₆ 吸光(guāng)值，用80%丙酮做空白(bái)對照(zhào)。

1.7.3 根據以下公式計(jì)算葉綠素：

葉綠素濃度（μg Chl/ml）=200×（17.32×OD₆₄₆+7.18×OD₆₆₃） 注：200爲稀釋倍數。

1.8 類囊體(tǐ)膜貯存：

将類囊體(tǐ)膜樣品用類囊體(tǐ)膜溶解液稀釋到濃度爲1mg Chl/ml，根據需要适量分(fēn)裝，如(rú)50 μl/管，-80℃保存。

1.9 類囊體(tǐ)膜樣品溶解和電泳：

類囊體(tǐ)膜增溶緩沖液配制：

将2.5 ml增溶緩沖液（2×）全部加入到增溶劑粉末中，加入滅菌水定容至5 ml，徹底混勻，即配成5 ml增溶緩沖液，适量分(fēn)裝，-20℃貯存，盡量避免反複凍融。

1.9.1 取50 μl(濃度爲1 mg Chl/ml)類囊體(tǐ)膜樣品, 4℃ 16000 g離(lí)心5分(fēn)鍾，棄上清。

1.9.2 沉澱中加入50 μl類囊體(tǐ)膜增溶緩沖液重懸樣品（此時樣品濃度爲1 mg Chl/ml），輕柔混勻，避免産生(shēng)大(dà)量氣泡，冰浴10 min； 4℃ 16000 g離(lí)心15 min；上清爲綠色，有微量沉澱。 注：如(rú)上清爲無色，說(shuō)明增溶不好。

1.10

 實驗示例：