植物葉綠體(tǐ)DNA提取試劑盒        

● 産品簡介：

葉綠體(tǐ)（Chloroplast）是質體(tǐ)的一種, 是高等植物和一些藻類所特有的能量轉換器，是光(guāng)合作(zuò)用的反應場所。在高等植物中葉綠體(tǐ)爲雙凸或平凸透鏡，長徑5~10μm，短(duǎn)徑2~4μm，厚2~3μm。高等植物的葉肉細胞一般含50～200個葉綠體(tǐ)，可(kě)占細胞質的40%，葉綠體(tǐ)的數目因物種細胞類型，生(shēng)态環境，生(shēng)理(lǐ)狀态而有所不同。葉綠體(tǐ)由葉綠體(tǐ)外被(chloroplast envelope)、類囊體(tǐ)(thylakoid)和基質(stroma)三部分(fēn)組成，含有3種不同的膜：外膜、内膜、類囊體(tǐ)膜和3種彼此分(fēn)開的腔：膜間隙、基質和類囊體(tǐ)腔。

葉綠體(tǐ)DNA（Chloroplast DNA，cpDNA），存在于葉綠體(tǐ)内，高等植物葉綠體(tǐ)的DNA爲雙鏈共價閉合環狀分(fēn)子，其長度随生(shēng)物種類而不同，其大(dà)小在120 kb到217 kb之間，相(xiàng)當于噬菌體(tǐ)基因組的大(dà)小雙鏈環狀，一個葉綠體(tǐ)含有10~50個cpDNA。

本試劑盒是結合植物葉綠體(tǐ)純化試劑盒和離(lí)心柱式植物DNA提取試劑盒而推出的新産品，專門(mén)用于植物葉綠體(tǐ)DNA的快(kuài)速提取。

1. 純度高，不含污染和抑制劑，可(kě)以直接用于酶切、PCR、real-time PCR、 multiplex PCR、RAPD、RFLP、AFLP、Southern Blotting, microsatellite analysis等各種後續分(fēn)子生(shēng)物學實驗。

2. 以每次處理(lǐ)30 g葉片計(jì)算，本産品可(kě)使用8-10次提取植物葉綠體(tǐ)，每次能得(de)到3-5 mg左右葉綠體(tǐ)。按照(zhào)每次使用0.2 ml 葉綠體(tǐ)溶液計(jì)算，可(kě)以至少提取50次葉綠體(tǐ)DNA的純化。cpDNA 産率一般在1-2 μg/1 g葉片樣品。OD260/280一般在1.8以上。DNA片段長度一般在40-50 Kb左右。

3. 已經成功用于菠菜，大(dà)豆，莴筍，白(bái)菜，煙草和甜菜等雙子葉植物，也适用于單子葉等其他(tā)植物（可(kě)能需要優化條件(jiàn)）。

● 貯存及運輸：

4-8℃保存，至少一年(nián)有效；試劑盒常溫運輸。

● 産品組成：

● 使用說(shuō)明：

一 植物葉綠體(tǐ)提取：

注意：葉綠體(tǐ)對溫度高度敏感，所以整個操作(zuò)必須在冰上或者在冷(lěng)室進行，所用器皿和溶液均需要在4℃預冷(lěng)。葉綠體(tǐ)提取過程中離(lí)心時一定要在4℃進行，離(lí)心力以g而不是rpm計(jì)算。如(rú)果需要研究葉綠體(tǐ)的功能，提取過程還(hái)需要在昏暗的光(guāng)線條件(jiàn)下進行。

需要自(zì)備材料：

剪刀；50 ml尖底或圓底離(lí)心管；15 ml尖底或圓底離(lí)心管；漏鬥；勻漿機(jī)；低溫離(lí)心機(jī)。

1.1 材料預處理(lǐ)：

實驗前1-2天将植物放(fàng)在暗室培養以減少葉綠體(tǐ)中澱粉顆粒的形成，否則離(lí)心時這些顆粒很容易使葉綠體(tǐ)破裂。葉片在實驗前需先用自(zì)來(lái)水洗淨，再用蒸餾水淋洗，去(qù)掉多餘水分(fēn)。如(rú)果葉片采集後不能立即處理(lǐ)，則保存時需要保持葉片濕潤，即使如(rú)此，葉片采集後的放(fàng)置時間也不能超過一天。

1.2  1×葉綠體(tǐ)提取緩沖液（即用型）配制：

注：一個30克樣品提取反應需要 150 ml 1×葉綠體(tǐ)提取緩沖液（即用型）。

1.3 葉片勻漿：

1.3.1 新鮮采集植物葉片，快(kuài)速去(qù)除葉脈（約30克）并将葉片剪成1-3 cm²大(dà)小的碎片并浸泡在150 ml的預冷(lěng)的1×葉綠體(tǐ)提取緩沖液（即用型）中（每克葉片加5 ml）。

1.3.2 将浸泡了葉片的溶液轉移到勻漿機(jī)（貨号：RT-2243A）中，低速勻漿10秒，避免起泡沫。用玻璃棒把液面的碎片按入勻漿機(jī)底部後，再低速勻漿10秒，重複10秒勻漿3-4次至葉片破碎即可(kě)，不要過分(fēn)勻漿，否則會降低完整葉綠體(tǐ)的得(de)率。

1.3.3 用2層過濾紙置于小漏鬥上，将勻漿液過濾收集到預冷(lěng)的250 ml量筒中，一般更換三次濾紙可(kě)收集約120 ml濾液，将濾液等分(fēn)到4個預冷(lěng)的50 ml的塑料離(lí)心管中（每個管中的濾液不要超過35 ml）。

1.4 離(lí)心去(qù)雜質：

4℃ 200 g離(lí)心5分(fēn)鍾，保留上清，沉澱爲未破裂植物組織、細胞或細胞核（下圖）；如(rú)果樣品中澱粉含量較高，沉澱可(kě)能爲白(bái)色。

注：此步驟用低速離(lí)心去(qù)除雜質，不能省略，否則得(de)到的葉綠體(tǐ)DNA中會有核基因組的污染。

1.5 收集葉綠體(tǐ)粗提液：

1.5.1将步驟1.4得(de)到的上清液平分(fēn)到4個預冷(lěng)的50 ml塑料離(lí)心管中；4℃ 1100 g離(lí)心15分(fēn)鍾，小心棄上清，沉澱含葉綠體(tǐ)，呈深綠色（下圖）。

1.5.2 在沉澱中加入1.5 ml 預冷(lěng)的1×葉綠體(tǐ)提取緩沖液（即用型），手彈離(lí)心管底部使葉綠體(tǐ)重懸，收集4管溶液（約6 ml），此溶液即爲葉綠體(tǐ)粗提産物。

1.5.3 如(rú)果對葉綠體(tǐ)DNA是否含細胞核DNA的要求不高，則葉綠體(tǐ)粗提液可(kě)以直接用于葉綠體(tǐ)DNA純化（步驟2.1）。

1.6 完整葉綠體(tǐ)的純化：

葉綠體(tǐ)重懸液配制

1.6.1 單梯度分(fēn)離(lí)法（适合菠菜，白(bái)菜，莴苣，拟南(nán)芥，綠蘿等）：

1.6.1.1 40%密度梯度液配制-10 ml：

在15 ml離(lí)心管中加入6 ml 1×葉綠體(tǐ)提取緩沖液（即用型）和4 ml密度梯度分(fēn)離(lí)試劑，充分(fēn)混合均勻，得(de)40%密度梯度液，冰浴備用。

1.6.1.2将10 ml 40%密度梯度液平分(fēn)到2個 15 ml離(lí)心管中，每管5 ml；将步驟1.5.2得(de)到的葉綠體(tǐ)粗提液3 ml小心鋪在5 ml密度梯度液之上；另一管重複。（5 ml 40%密度梯度液用可(kě)以分(fēn)離(lí)3 ml 葉綠體(tǐ)粗提液，其他(tā)體(tǐ)積以此比例換算）。

1.6.1.3  4℃ 3200 g離(lí)心30分(fēn)鍾，綠色沉澱爲完整葉綠體(tǐ)（下圖）。

注：如(rú)果最上層的分(fēn)離(lí)試劑不夠清亮，可(kě)以延長離(lí)心20分(fēn)鍾。

1.6.1.4 小心棄上清，保留沉澱，每管沉澱中加入1 ml 葉綠體(tǐ)重懸液，輕柔重懸，可(kě)以收集到2 ml完整葉綠體(tǐ)溶液。

1.6.1.5 此葉綠體(tǐ)溶液可(kě)以提取得(de)到無細胞核DNA污染的葉綠體(tǐ)DNA  

（步驟2.1）。

1.6.2雙梯度分(fēn)離(lí)法（适合煙草，甜菜，豌豆等）：

1.6.2.1 80%密度梯度重液配制-4 ml：

在15 ml離(lí)心管中加入0.8 ml 1×葉綠體(tǐ)提取緩沖液（即用型）和3.2 ml 密度梯度分(fēn)離(lí)試劑，充分(fēn)混合均勻，得(de)80%密度梯度重液。

1.6.2.2 40%密度梯度輕液配制-8 ml：

在另一15 ml離(lí)心管加入4.8 ml 1×葉綠體(tǐ)提取緩沖液（即用型）和3.2 ml 密度梯度分(fēn)離(lí)試劑，充分(fēn)混合均勻，得(de)40%密度梯度輕液。

1.6.2.3 取一隻15 ml離(lí)心管，加入1.86 ml 80%密度梯度重液，随後取3.74 ml 40%密度梯度輕液小心鋪在80%密度梯度重液之上，冰浴備用；然後取步驟1.5.2得(de)到的3 ml葉綠體(tǐ)粗提液小心鋪在密度梯度輕液之上。另一管重複。

注：每5.6 ml 40%/80%密度梯度液可(kě)以分(fēn)離(lí)3 ml 葉綠體(tǐ)粗提液；其他(tā)體(tǐ)積按照(zhào)比例調整。

1.6.2.4 4℃ 3200 g離(lí)心30分(fēn)鍾，上層綠色帶含破碎的葉綠體(tǐ)、線粒體(tǐ)和核糖體(tǐ)等，重液和輕液間的綠色帶爲完整葉綠體(tǐ)（下圖）。

注：如(rú)果最上層的分(fēn)離(lí)試劑不夠清亮，可(kě)以延長離(lí)心20分(fēn)鍾。

1.6.2.5 重懸葉綠體(tǐ)：

用廣口吸管小心将重液和輕液之間的綠色帶（完整葉綠體(tǐ)）轉  移到新的15 ml離(lí)心管中，加入三倍體(tǐ)積預冷(lěng)的葉綠體(tǐ)重懸液，輕柔混勻。

1.6.2.6 離(lí)心收集葉綠體(tǐ)：

4℃ 1750 g離(lí)心6分(fēn)鍾，小心将上清倒出後，在綠色的葉綠體(tǐ)沉澱中加入預冷(lěng)的1 ml葉綠體(tǐ)重懸液，手指輕彈管底使葉綠體(tǐ)重懸。最終可(kě)以收集到2 ml完整葉綠體(tǐ)溶液。

1.6.2.7此葉綠體(tǐ)溶液可(kě)以提取得(de)到無細胞核DNA污染的葉綠體(tǐ)DNA（步驟2.1）。

1.7 葉綠體(tǐ)貯存：

葉綠體(tǐ)可(kě)在顯微鏡下檢查葉綠體(tǐ)完整性。葉綠體(tǐ)重懸液避光(guāng)-80℃保存。葉綠體(tǐ)必須盡快(kuài)使用，否則非常容易失去(qù)活性。

1.8 葉綠素含量測定：

通常葉綠體(tǐ)含量用單位葉綠素含量來(lái)表示，即x mg 葉綠素/ml 葉綠體(tǐ)懸浮液。

1.8.1 取10 μl 葉綠體(tǐ)懸浮液加入到990 μl 80%丙酮溶液中，混勻。

1.8.2 3000 g 離(lí)心5分(fēn)鍾，取上清測定OD₆₅₂ 吸光(guāng)值，用80%丙酮做空白(bái)對照(zhào)。

1.8.3 根據以下公式計(jì)算葉綠素：

葉綠素濃度（mg/ml）=（OD₆₅₂×100）/36

100：稀釋倍數

36：extinction coefficient in ml/cm·mg

二 葉綠體(tǐ)DNA提取：

注：以下離(lí)心操作(zuò)可(kě)以常溫下進行。

2.1 取0.2-0.4 ml葉綠體(tǐ)溶液，3500 g離(lí)心2分(fēn)鍾，小心棄上清，沉澱爲葉綠體(tǐ)。

   注：可(kě)以根據提取的葉綠體(tǐ)濃度大(dà)體(tǐ)估算提取到的cpDNA濃度。經驗值：每50 μg 葉綠體(tǐ)（葉綠素濃度）可(kě)以提取到1μg cpDNA。

2.2葉綠體(tǐ)沉澱中加入400 μl 緩沖液AP1和6 μl RNaseA (10mg/ml)，漩渦震蕩1分(fēn)鍾。

2.3 将離(lí)心管放(fàng)在65℃水浴10分(fēn)鍾，水浴過程中颠倒離(lí)心管以混合樣品數次。

2.4 加入130 μl 緩沖液AP2，颠倒混勻，冰浴5分(fēn)鍾。

2.5 12,000 rpm離(lí)心5分(fēn)鍾，保留上清，上清通常爲無色，沉澱爲綠色。注：此步驟離(lí)心去(qù)除去(qù)垢劑，蛋白(bái)以及多糖等雜質。

2.6 将上清（通常可(kě)取到400 μl）轉移到1.5 ml離(lí)心管中，加入1.5倍體(tǐ)積（例如(rú)400 μl的上清液加600 μl）緩沖液AP3（使用前請(qǐng)注意是否已經加入無水乙醇），立即颠倒混勻，簡短(duǎn)離(lí)心以去(qù)除管蓋内壁的水珠。

2.7吸取步驟2.6中的混合液加入到吸附柱CG中（吸附柱放(fàng)入收集管中），12,000 rpm離(lí)心1分(fēn)鍾，倒掉廢液，吸附柱CG放(fàng)回收集管中。

注：離(lí)心吸附柱的最大(dà)容積是700 μl，如(rú)果一次不能完全上柱，可(kě)以分(fēn)次上柱離(lí)心，保證全部溶液全部加到離(lí)心柱中。

2.8向吸附柱CG中加入700 μl漂洗液PW（使用前請(qǐng)先檢查是否已加入無水乙醇），12,000 rpm離(lí)心1分(fēn)鍾，倒掉廢液，吸附柱CG放(fàng)入收集管中。

2.9向吸附柱CG中加入500 μl漂洗液PW（使用前請(qǐng)先檢查是否已加入無水乙醇），12,000 rpm離(lí)心1分(fēn)鍾，倒掉廢液，吸附柱CG放(fàng)入收集管中。

2.10将吸附柱CG放(fàng)回廢液收集管中，12,000 rpm離(lí)心2分(fēn)鍾。

注：此步驟非常重要，目的是将吸附柱中殘餘的漂洗液去(qù)除。漂洗液中乙醇的殘留會影(yǐng)響後續的酶反應（酶切、PCR等）實驗。

2.11将吸附柱CG轉入一個幹淨的1.5ml離(lí)心管中，向吸附膜的中間部位懸空滴加50-100 μl經65℃水浴預熱(rè)的洗脫緩沖液EB，室溫放(fàng)置2分(fēn)鍾，12,000 rpm g離(lí)心2分(fēn)鍾。

注：洗脫緩沖液體(tǐ)積不要少于50 μl，體(tǐ)積過小影(yǐng)響回收效率；洗脫液的pH值對于洗脫效率有很大(dà)影(yǐng)響。若用水做洗脫液應保證其pH值在7.0-8.5範圍内，pH值低于7.0會降低洗脫效率。

2.12  葉綠體(tǐ)DNA産物-20℃保存。

三 實驗示例：

3.1 葉綠體(tǐ)提取示例：

30克綠蘿葉片，加入150 ml 1×葉綠體(tǐ)提取緩沖液（即用型）  勻漿5×10秒，3次過濾共收集120 ml過濾液，平分(fēn)4管，4℃ 1100 g 離(lí)心15 min，棄上清，每管重懸于1.5 ml 1×葉綠體(tǐ)提取緩沖液（即用型）中，共得(de)到6 ml 葉綠體(tǐ)粗提液。2×3 ml 粗提液平鋪于2×5 ml 40%密度梯度液之上，4℃ 3200 g離(lí)心15分(fēn)鍾，棄上清，每管沉澱重懸于1 ml 葉綠體(tǐ)重懸液中，共得(de)到2 ml精制葉綠體(tǐ)重懸液，測定葉綠素含量爲3.43 mg/ml重懸液。30克葉片提取得(de)到6.86 mg葉綠體(tǐ)。取10 μl葉綠體(tǐ)溶液稀釋20倍，取50 μl稀釋液顯微鏡40倍物鏡觀察，如(rú)下圖。

3.2 葉綠體(tǐ)DNA電泳示例：

葉綠體(tǐ)提取同3.1。取100 μl葉綠體(tǐ)重懸液，提取cpDNA，最後用50 μl洗脫，上樣5 μl，電泳結果見(jiàn)下圖左二泳道，cpDAN大(dà)小約20kb，無可(kě)見(jiàn)核基因組污染。