柱式植物葉綠體(tǐ)提取試劑盒  (微量樣品)      

● 産品簡介：

葉綠體(tǐ)（Chloroplast）是質體(tǐ)的一種, 是高等植物和一些藻類所特有的能量轉換器，是光(guāng)合作(zuò)用的反應場所。在高等植物中葉綠體(tǐ)爲雙凸或平凸透鏡，長徑5~10μm，短(duǎn)徑2~4μm，厚2~3μm。高等植物的葉肉細胞一般含50～200個葉綠體(tǐ)，可(kě)占細胞質的40%，葉綠體(tǐ)的數目因物種細胞類型，生(shēng)态環境，生(shēng)理(lǐ)狀态而有所不同。葉綠體(tǐ)由葉綠體(tǐ)外被(chloroplast envelope)、類囊體(tǐ)(thylakoid)和基質(stroma)三部分(fēn)組成，含有3種不同的膜：外膜、内膜、類囊體(tǐ)膜和3種彼此分(fēn)開的腔：膜間隙、基質和類囊體(tǐ)腔。本公司的植物葉綠體(tǐ)提取試劑盒采用密度梯度離(lí)心方法，可(kě)以從(cóng)多種植物中提取高純度的葉綠體(tǐ)。

1. 即用型試劑盒，用戶不需要單獨配制各種溶液。

2. 不需要液氮研磨葉片，可(kě)以從(cóng)50-100 mg材料中提取葉綠體(tǐ)，方便使用。

3. 試劑盒可(kě)以用于葉綠體(tǐ)粗提，所得(de)葉綠體(tǐ)含少量其他(tā)細胞器污染，可(kě)用于後續的SDS-PAGE，Western，ELISA和蛋白(bái)組分(fēn)析。也可(kě)以用于葉綠體(tǐ)精提，所得(de)葉綠體(tǐ)完整，可(kě)用于後續的光(guāng)合作(zuò)用，電子鏈和磷酸化，跨膜轉運，體(tǐ)外葉綠體(tǐ)蛋白(bái)合成，蛋白(bái)定位等研究。還(hái)可(kě)用于葉綠體(tǐ)膜，基質，類囊體(tǐ)的提取以及葉綠體(tǐ)DNA和葉綠體(tǐ)RNA純化。

4. 以每次處理(lǐ)0.1 g葉片計(jì)算，本産品可(kě)使用50次提取，每次能得(de)到20-30 μg葉綠體(tǐ)（葉綠素定量）。

5. 已經成功用于拟南(nán)芥，綠蘿，菠菜，大(dà)豆，莴筍，白(bái)菜，煙草和甜菜等植物，還(hái)可(kě)用于更多植物（可(kě)能需要優化條件(jiàn)）。

   注：本産品适合于少量葉片（50-100 mg）葉綠體(tǐ)的提取，大(dà)量葉片葉綠體(tǐ)提取（每次處理(lǐ)30 g葉片）請(qǐng)選擇RTU5001 植物葉綠體(tǐ)提取試劑盒。

● 貯存及運輸：

4-8℃保存；有效期一年(nián)；試劑盒常溫運輸。

● 産品組成：

● 使用說(shuō)明：

注意：葉綠體(tǐ)對溫度高度敏感，所以整個操作(zuò)必須在冰上或者在冷(lěng)室進行，所用器皿和溶液均需要在4℃預冷(lěng)。離(lí)心時一定要在4℃進行，離(lí)心力以g而不是rpm計(jì)算。如(rú)果需要研究葉綠體(tǐ)的功能，提取過程還(hái)需要在昏暗的光(guāng)線條件(jiàn)下進行。

需要自(zì)備材料：

剪刀；1.5 離(lí)心管；低溫離(lí)心機(jī)。

一 葉綠體(tǐ)提取：

1.1 材料預處理(lǐ)：

實驗前1-2天将植物放(fàng)在暗室培養以減少葉綠體(tǐ)中澱粉顆粒的形成，否則離(lí)心時這些顆粒很容易使葉綠體(tǐ)破裂。葉片在實驗前需先用自(zì)來(lái)水洗淨，再用蒸餾水淋洗，去(qù)掉多餘水分(fēn)。如(rú)果葉片采集後不能立即處理(lǐ)，則保存時需要保持葉片濕潤，即使如(rú)此，葉片采集後的放(fàng)置時間也不能超過一天。

1.2 葉片研磨：

1.2.1 取50-100 mg新鮮采集植物樣品（葉片，軟莖等），剪成1-3 cm²大(dà)小的碎片放(fàng)入離(lí)心柱内。

注：樣品質量盡量控制在100 mg以内，有利于後續充分(fēn)研磨。

1.2.2 加入0.1 ml 預冷(lěng)的提取緩沖液，用塑料研磨棒向下擠壓旋轉研磨樣品20-30次（大(dà)約用時1-2分(fēn)鍾），至樣品無可(kě)見(jiàn)大(dà)塊組織碎片，再補加0.3 ml 提取緩沖液，用吸頭混勻。

注：塑料研磨棒可(kě)以水洗後重複使用。

1.3 離(lí)心去(qù)雜質：

蓋好2 ml收集管管蓋，4℃ 2000 g（約4600 rpm）離(lí)心 5分(fēn)鍾。

1.4 粗葉綠體(tǐ)提取：

1.4.1 棄離(lí)心柱，吸頭吸棄離(lí)心管内上清，保留沉澱。

注：如(rú)沉澱離(lí)心後不實，可(kě)以重懸沉澱後再次離(lí)心收集沉澱。

1.4.2 沉澱中加入0.1 ml漂洗緩沖液，輕輕重懸，溶液即爲葉綠體(tǐ)粗提液。

注：100 mg葉片提取的粗葉綠體(tǐ)，溶于0.1 ml漂洗緩沖液中，葉綠體(tǐ)濃度約爲0.6-1 μg Chl/μl（葉綠體(tǐ)濃度測定見(jiàn)步驟1.6），可(kě)以将多管葉綠體(tǐ)溶液4℃ 4200 g 離(lí)心5分(fēn)鍾，合并葉綠體(tǐ)沉澱，用漂洗緩沖液将葉綠體(tǐ)濃度調整爲 1 μg Chl/μl（1 mg Chl/ml），分(fēn)裝爲50 μl每隻，-80℃貯存。

1.5 精制葉綠體(tǐ)提取：

1.5.1即用型梯度分(fēn)離(lí)液配制：

在幹淨的1.5 ml離(lí)心管中加入0.4 ml 密度梯度分(fēn)離(lí)試劑和0.6 ml漂洗緩沖液，渦旋徹底混勻。

1.5.2 将步驟1.4.2的0.1 ml葉綠體(tǐ)粗提液緩慢(màn)加入到即用型梯度分(fēn)離(lí)液上方。

1.5.3 4℃ 4200 g（約6600 rpm）離(lí)心10分(fēn)鍾，小心棄上清，沉澱爲精制葉綠體(tǐ)。

1.5.4 在沉澱中加入0.5 ml 漂洗緩沖液，輕柔重懸沉澱。

1.5.5 4℃ 4200 g（約6600 rpm）離(lí)心5分(fēn)鍾，棄上清，保留沉澱。

1.5.6沉澱中加入0.1 ml漂洗緩沖液，輕輕重懸，溶液即爲精制葉綠體(tǐ)。

注：100 mg葉片提取的精制葉綠體(tǐ)，溶于0.1 ml漂洗緩沖液中，葉綠體(tǐ)濃度約爲0.3-0.7 μg Chl/μl（葉綠體(tǐ)濃度測定見(jiàn)步驟1.6），可(kě)以将多管葉綠體(tǐ)溶液4℃ 4200 g 離(lí)心5分(fēn)鍾，合并葉綠體(tǐ)沉澱，用漂洗緩沖液将葉綠體(tǐ)濃度調整爲 1 μg Chl/μl（1 mg Chl/ml），分(fēn)裝爲50 μl每隻，-80℃貯存。

1.6 葉綠素含量測定：

通常葉綠體(tǐ)含量用單位葉綠素（Chl）含量來(lái)表示，即x mg Chl/ml 葉綠體(tǐ)懸浮液。

1.6.1 取10 μl 葉綠體(tǐ)懸浮液加入到990 μl 95%乙醇溶液中，混勻。

1.6.2測定OD₆₄₉和OD₆₆₅ 吸光(guāng)值，用95%乙醇做空白(bái)對照(zhào)。

1.6.3 根據以下公式計(jì)算葉綠素：

葉綠素濃度（mg/ml）=100×（18.16×OD₆₄₉+6.63×OD₆₆₅）

100：稀釋倍數

二. 葉綠體(tǐ)的使用：

2.1 葉綠體(tǐ)功能研究：

如(rú)果用于完整葉綠體(tǐ)的功能或酶活性研究，初始100 mg樣品分(fēn)離(lí)得(de)到的葉綠體(tǐ)樣品調整葉綠體(tǐ)濃度爲1 μg Chl/μl，50 μl/管分(fēn)裝， -80℃貯存備用。不建議(yì)長期貯存，盡快(kuài)使用。

2.2 葉綠體(tǐ)蛋白(bái)電泳：

2.2.1葉綠體(tǐ)蛋白(bái)變性樣品處理(lǐ)：

2.2.1.1 取50 μl葉綠體(tǐ)溶液（1 μg Chl/μl）；

2.2.1.2 4℃ 4200g 離(lí)心5分(fēn)鍾，棄上清，沉澱中加入SDS-PAGE上樣緩沖液（貨号：PL080，PL113，PL121）處理(lǐ)，建議(yì)調整上樣液濃度爲0.5 μg/μl；對于多次跨膜蛋白(bái)（Multi-pass membrane protein）的變性電泳檢測，樣品建議(yì)使用37℃處理(lǐ)30分(fēn)鍾，不要95℃加熱(rè)5分(fēn)鍾，因爲在95℃高溫情況下，多次跨膜蛋白(bái)極易聚集形成多聚體(tǐ)，樣品會聚集，WB檢測會表現爲比實際蛋白(bái)大(dà)小更大(dà)的分(fēn)子量；

2.2.1.3 使用SDS-PAGE凝膠（貨号：RTD6132，RTD6116）電泳，每個泳道上樣10-40 μl（5-20 μg）。

2.2.2 葉綠體(tǐ)蛋白(bái)BN非變性樣品處理(lǐ)：

2.2.2.1取50 μl葉綠體(tǐ)溶液（1 μg Chl/μl）；；

2.2.2.2 4℃ 4200g 離(lí)心5分(fēn)鍾，棄上清，沉澱中加入50 μl 類囊體(tǐ)膜增溶緩沖液，輕柔重懸沉澱，盡量不産生(shēng)氣泡，冰浴10分(fēn)鍾；

2.2.2.3 4℃ 16000 g 10分(fēn)鍾，取上清至一幹淨1.5 ml離(lí)心管中即爲增溶後葉綠體(tǐ)蛋白(bái)溶液（小心不要吸取沉澱），此時得(de)到的葉綠體(tǐ)蛋白(bái)濃度爲1 μg/μl，其中去(qù)垢劑DDM（n-Dodecyl β-D-maltoside，β-DM， n-十二烷基-β-D-麥芽糖苷）終濃度爲2%；

2.2.2.4 葉綠體(tǐ)蛋白(bái)溶液中加入1/10體(tǐ)積類囊體(tǐ)膜上樣緩沖液（10×），使用BN凝膠電泳（貨号：RTD6139，RTD6140），每個泳道上樣5-20 μg。

2.2.3 葉綠體(tǐ)蛋白(bái)等電聚焦樣品處理(lǐ)（2D凝膠第一維電泳）：

建議(yì)葉綠體(tǐ)沉澱中使用溶解液：7 M尿素，2 M硫脲，2%CHAPS，20 mM DTT(自(zì)備，試劑盒不提供)。

三 實驗示例：

程序：取0.1克新鮮綠蘿葉片加入到離(lí)心柱内，加入0.1 ml提取緩沖液，研磨20次，再加入0.3 ml提取緩沖液（平行做6管）；4度 2000g 離(lí)心5分(fēn)鍾；棄上清，沉澱中加入0.1ml漂洗緩沖液，合并6管得(de)到0.6 ml粗葉綠體(tǐ)，保留0.2ml粗葉綠體(tǐ)。取0.1ml粗葉綠體(tǐ)加到1ml即用型梯度分(fēn)離(lí)液上層（0.4 ml密度梯度分(fēn)離(lí)試劑加0.6ml漂洗緩沖液），平行做4管；4度 4200g 離(lí)心10分(fēn)鍾，棄上清，沉澱中加入0.5ml漂洗液清洗一次，4度 4200g 離(lí)心5分(fēn)鍾，4管精制葉綠體(tǐ)沉澱合并收集于0.1ml漂洗液中。用乙醇方法測定葉綠體(tǐ)濃度，調整粗葉綠體(tǐ)和精制葉綠體(tǐ)濃度均爲1μg Chl/μl；取50μl葉綠體(tǐ)溶液，離(lí)心，沉澱中加入50 μl類囊體(tǐ)膜增溶緩沖液，冰浴10分(fēn)鍾，4度 16000g 離(lí)心10分(fēn)鍾取上清，加入1/10體(tǐ)積類囊體(tǐ)膜上樣緩沖液（10×），此時葉綠體(tǐ)蛋白(bái)濃度爲1μg/μl，上樣10 μl和20 μl。

電泳：RTD6138-0312  3-12%BN膠，1×BN buffer+0.02%G-250，200V 15-3.5mA 50 min

更換1×無色BN buffer 200V繼續電泳，時間共103 min，FastBlue蛋白(bái)染色液染色30分(fēn)鍾。