2×ligation solution MasterMix
2×DNA連接緩沖液
● 産品組成：
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貨号
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名稱
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規格
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RTV701
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2×ligation solution MasterMix
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150 μl
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注；按照(zhào)10μl連接體(tǐ)系計(jì)算，每次使用5μl，可(kě)以使用30次。
● 保存：-20℃
● 産品簡介：
2×ligation solution MasterMix是含有T4 DNA Ligase，ligation buffer的2×MasterMix，實驗時，隻需加入片段和載體(tǐ)即可(kě)進行連接反應。
适用于DNA片段和載體(tǐ)DNA的連接以及DNA片段和Linker或Adaptor DNA的連接。
● 注意事(shì)項
1．2×ligation solution MasterMix由于含有T4 DNA ligase，使用前冰浴中徹底融化，混勻後使用。
2．爲了提高轉化效率，轉化時建議(yì)所加入連接産物的量不要超過感受态細胞體(tǐ)積的10%。
● 使用方法：
一 DNA片段和載體(tǐ)DNA的連接
1）粘性末端的連接
1．反應體(tǐ)系:
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10μl體(tǐ)系
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終濃度
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線性載體(tǐ)DNA
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x μl
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10-50 ng
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插入DNA片段
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y μl
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插入片段：載體(tǐ)=1:1-5:1*
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2×ligation solution MasterMix
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5 μl
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1×
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ddH2O
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up to 10 μl
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*：載體(tǐ)與插入片段的摩爾數比需要優化：一般vector:insert在1:1~1:5之間均可(kě)得(de)到較好的結果。用以下公式計(jì)算片段摩爾數：pmol數= DNA量(ng)/(660×片段bp數)×1000。例如(rú)：插入片段2000bp，線性載體(tǐ)爲3000bp，如(rú)果載體(tǐ)使用量爲50ng（0.025pmol），10μl連接體(tǐ)系中vector:insert的摩爾比是1:3，則需要2000bp pmol數爲0.075pmol，插入片段2000bp的使用量爲100ng。
2．徹底輕柔混勻後，瞬間離(lí)心，将管壁上的溶液收集到管底。
3．反應條件(jiàn)：16℃孵育30分(fēn)鍾。
4．可(kě)取5 μl連接産物熱(rè)擊轉化50 μl感受态細胞或取1-2 μl連接産物電擊轉化50 μl感受态細胞。
注：1）若要提高電轉實驗效率，推薦65℃孵育10分(fēn)鍾或70℃孵育5分(fēn)鍾以滅活T4 DNA Ligase後，用DNA産物純化試劑盒或氯仿抽提對連接後的DNA片段進行純化後進行電擊轉化。
2）若要提高轉化子數目，可(kě)将連接時間延長至1小時。
2）平末端的連接
1．反應體(tǐ)系:
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10μl體(tǐ)系
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終濃度
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線性平末端載體(tǐ)DNA*
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x μl
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10-50 ng
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插入DNA片段
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y μl
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插入片段：載體(tǐ)=1:1-5:1**
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2×ligation solution MasterMix
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5 μl
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1×
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ddH2O
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up to 10 μl
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*：平滑末端的載體(tǐ)與 DNA 片段進行連接時，應首先将載體(tǐ)進行去(qù)磷酸化處理(lǐ)，以防止其自(zì)身(shēn)環化。
**：載體(tǐ)與插入片段的摩爾數比需要優化：一般vector:insert在1:1~1:5之間均可(kě)得(de)到較好的結果。用以下公式計(jì)算片段摩爾數：pmol數= DNA量(ng)/(660×片段bp數)×1000。例如(rú)：插入片段2000bp，線性載體(tǐ)爲3000bp，如(rú)果載體(tǐ)使用量爲50ng（0.025pmol），10μl連接體(tǐ)系中vector:insert的摩爾比是1:3，則需要2000bp pmol數爲0.075pmol，插入片段2000bp的使用量爲100ng。
2．徹底輕柔混勻後，瞬間離(lí)心，将管壁上的溶液收集到管底。
3．反應條件(jiàn)：16℃孵育30分(fēn)鍾。
4．可(kě)取5 μl連接産物熱(rè)擊轉化50 μl感受态細胞或取1-2 μl連接産物電擊轉化50 μl感受态細胞。
注：1）若要提高電轉實驗效率，推薦65℃孵育10分(fēn)鍾或70℃孵育5分(fēn)鍾以滅活T4 DNA Ligase後，用DNA産物純化試劑盒或氯仿抽提對連接後的DNA片段進行純化後才能進行電擊轉化。
2）若要提高轉化子數目，可(kě)将連接時間延長至1小時。
二 線性DNA的自(zì)身(shēn)環化
1．反應體(tǐ)系:
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10μl體(tǐ)系
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終濃度
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線性載體(tǐ)DNA
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x μl
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10-50 ng
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2×ligation solution MasterMix
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5 μl
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1×
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ddH2O
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up to 10 μl
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2．徹底輕柔混勻後，瞬間離(lí)心，将管壁上的溶液收集到管底。
3．反應條件(jiàn)：16℃孵育30分(fēn)鍾。
4．可(kě)取5 μl連接産物熱(rè)擊轉化50 μl感受态細胞或取1-2 μl連接産物電擊轉化50 μl感受态細胞。
注：1）若要提高電轉實驗效率，推薦65℃孵育10分(fēn)鍾或70℃孵育5分(fēn)鍾滅活T4 DNA Ligase後，用DNA産物純化試劑盒或氯仿抽提對連接後的DNA片段進行純化後才能進行電擊轉化。
三 接頭連接
1．反應體(tǐ)系:
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10μl體(tǐ)系
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終濃度
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線性DNA
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x μl
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100-300 ng
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磷酸化接頭
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y μl
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0.5-1 μg
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2×ligation solution MasterMix
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5 μl
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1×
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ddH2O
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up to 10 μl
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2．徹底輕柔混勻後，瞬間離(lí)心，将管壁上的溶液收集到管底。
3．反應條件(jiàn)：16℃孵育30分(fēn)鍾。
4．65℃孵育10分(fēn)鍾或70℃孵育5分(fēn)鍾滅活T4 DNA Ligase。連接産物可(kě)以直接進行限制性内切酶酶切反應。