Western及IP細胞裂解液(無抑制劑)
● 産品包裝:
産品編号
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産品名稱
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産品包裝
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說(shuō)明書(shū)
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WL0120F
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Western及IP細胞裂解液(無抑制劑)
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100 ml
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1份
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● 産品簡介:
Western及IP細胞裂解液(Cell
lysis buffer for Western and IP without inhibitors),是一種在非變性條件(jiàn)下裂解細胞的裂解液。本細胞裂解液裂解能力比較溫和,可(kě)以用于PAGE,Western,免疫沉澱(immunol precipitation,IP)和免疫共沉澱(Co-IP)。裂解液的主要成分(fēn)爲20 mM
Tris (pH7.5),150 mM NaCl,1% Triton X-100等,裂解後能維持原有的蛋白(bái)間相(xiàng)互作(zuò)用。由于含有較高濃度的Triton X-100等幹擾物質,不能用傳統Bradford法測定由本裂解液裂解得(de)到樣品的蛋白(bái)濃度,可(kě)以使用BCA蛋白(bái)濃度測定試劑盒(貨号:RTP7102)或Bradford蛋白(bái)濃度測定試劑盒(去(qù)垢劑兼容型)(貨号:RTP7104)測定蛋白(bái)濃度。使用本裂解液時,用戶可(kě)以根據具體(tǐ)用途自(zì)行添加特定抑制劑或者不添加抑制劑。
● 保存條件(jiàn):
-20℃保存,一年(nián)有效。
● 注意事(shì)項:
1.爲取得(de)最佳的使用效果,盡量避免過多的反複凍融。可(kě)以适當分(fēn)裝後使用。
2. 需自(zì)備PMSF或其他(tā)蛋白(bái)酶抑制劑;如(rú)進行蛋白(bái)磷酸化研究,還(hái)需要自(zì)備磷酸酶抑制劑。
3. 裂解樣品的所有步驟都(dōu)需在冰上或4℃進行。
● 使用說(shuō)明:
1. 準備裂解液:
溶解裂解液,混勻;取适當量的裂解液,在使用前數分(fēn)鍾内加入1/100體(tǐ)積的100 mM PMSF,使PMSF的最終濃度爲1 mM。如(rú)進行蛋白(bái)磷酸化研究,需要加入磷酸酶抑制劑。
2. 細胞蛋白(bái)提取:
2.1 貼壁細胞:去(qù)除培養液,加入适量1×PBS,輕柔漂洗一遍,不要擾動貼壁細胞。按照(zhào)6孔闆每孔加入100-200 μl裂解液的比例加入裂解液,移液器吹打數下,使裂解液和細胞充分(fēn)接觸,冰上裂解細胞5分(fēn)鍾,用細胞刮刀刮下細胞收集于1.5 ml離(lí)心管中,冰上繼續裂解15分(fēn)鍾,間歇混勻。
培養闆規格/培養皿表面積
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細胞量
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裂解液推薦使用量
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100 mm培養皿
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1.5×107
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0.5-1 ml
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60 mm培養皿
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5×106
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0.25-0.5 ml
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35 mm培養皿
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2×106
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0.2-0.4 ml
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6孔闆
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2.5×106
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100-200 μl
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24孔闆
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5×105
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100-150 μl
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96孔闆
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1×105
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50-100 μl
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2.2 懸浮細胞:450 g
4℃ 離(lí)心5 min收集細胞;用适量1×PBS重懸細胞,450 g 4℃ 離(lí)心5 min收集細胞;重複漂洗細胞一次;按照(zhào)細胞沉澱體(tǐ)積(PCV)20 μl加入200 μl 裂解液,混勻細胞沉澱,冰浴處理(lǐ)15分(fēn)鍾,間歇混勻。
注:2×106 Jurkat細胞,其細胞沉澱體(tǐ)積(PCV,Packed Cell Volume)大(dà)約爲20 μl。
2.3 裂解細胞:
用玻璃勻漿器勻漿,直至充分(fēn)裂解或通過強烈渦旋震蕩使樣品裂解充分(fēn)。冰浴處理(lǐ)15分(fēn)鍾。
注:裂解混合物不建議(yì)使用超聲波破碎儀處理(lǐ),因爲超聲波處理(lǐ)比較劇(jù)烈,容易破壞蛋白(bái)的相(xiàng)互作(zuò)用導緻蛋白(bái)變性。
2.4 離(lí)心收集上清:
充分(fēn)裂解後,4℃ 16000
g離(lí)心10分(fēn)鍾,取上清,即可(kě)進行後續的PAGE、Western和免疫沉澱等操作(zuò)。
3. 組織樣品蛋白(bái)提取:
3.1 手術(shù)切除的組織塊迅速置于預冷(lěng)的生(shēng)理(lǐ)鹽水中,漂洗數次,洗淨組織血迹,用濾紙吸幹組織表面液體(tǐ),将組織切成細小的碎片。
3.2 按照(zhào)每20 mg組織加入200 μl裂解液的比例加入裂解液。(如(rú)果裂解不充分(fēn)可(kě)以适當添加更多的裂解液,如(rú)果需要高濃度的蛋白(bái)樣品,可(kě)以适當減少裂解液的用量。)
3.3 用玻璃勻漿器冰浴勻漿5-10次,收集勻漿後的裂解混合物。裂解物冰浴處理(lǐ)15分(fēn)鍾。
注:裂解混合物不建議(yì)使用超聲波破碎儀處理(lǐ),因爲超聲波處理(lǐ)比較劇(jù)烈,容易破壞蛋白(bái)的相(xiàng)互作(zuò)用導緻蛋白(bái)變性。
3.4 充分(fēn)裂解後,4℃ 16000
g離(lí)心10分(fēn)鍾,取上清,即可(kě)進行後續的PAGE、Western和免疫沉澱等操作(zuò)。