Western及IP細胞裂解液

● 産品包裝：

● 産品簡介：

Western及IP細胞裂解液(Cell lysis buffer for Western and IP)，是一種在非變性條件(jiàn)下裂解細胞的裂解液。本細胞裂解液裂解的細胞，可(kě)以用于PAGE，Western，免疫沉澱(immunol precipitation，IP)和免疫共沉澱(Co-IP)。裂解液的主要成分(fēn)爲20 mM Tris (pH7.5)，150 mM NaCl，1% Triton X-100等，裂解後能維持原有的蛋白(bái)間相(xiàng)互作(zuò)用。由于含有較高濃度的Triton X-100等幹擾物質，不能用傳統Bradford法測定由本裂解液裂解得(de)到樣品的蛋白(bái)濃度，可(kě)以使用BCA蛋白(bái)濃度測定試劑盒（貨号：RTP7102）或Bradford蛋白(bái)濃度測定試劑盒（去(qù)垢劑兼容型）（貨号：RTP7104）測定蛋白(bái)濃度。

● 保存條件(jiàn)：

-20℃保存，一年(nián)有效。

● 注意事(shì)項：

1.爲取得(de)最佳的使用效果，盡量避免過多的反複凍融。可(kě)以适當分(fēn)裝後使用。

2. 需自(zì)備PMSF或其他(tā)蛋白(bái)酶抑制劑；如(rú)進行蛋白(bái)磷酸化研究，還(hái)需要自(zì)備磷酸酶抑制劑。

3. 裂解樣品的所有步驟都(dōu)需在冰上或4℃進行。

● 使用說(shuō)明：

1.  準備裂解液：

溶解裂解液，混勻；取适當量的裂解液，在使用前數分(fēn)鍾内加入1/100體(tǐ)積的100 mM PMSF，使PMSF的最終濃度爲1 mM。如(rú)進行蛋白(bái)磷酸化研究，需要加入磷酸酶抑制劑。

2. 細胞蛋白(bái)提取：

2.1 貼壁細胞：去(qù)除培養液，加入适量1×PBS，輕柔漂洗一遍，不要擾動貼壁細胞。按照(zhào)6孔闆每孔加入100-200 μl裂解液的比例加入裂解液，移液器吹打數下，使裂解液和細胞充分(fēn)接觸，冰上裂解細胞5分(fēn)鍾，用細胞刮刀刮下細胞收集于1.5 ml離(lí)心管中，冰上繼續裂解15分(fēn)鍾，間歇混勻。

2.2 懸浮細胞：450 g 4℃ 離(lí)心5 min收集細胞；用适量1×PBS重懸細胞，450 g 4℃ 離(lí)心5 min收集細胞；重複漂洗細胞一次；按照(zhào)細胞沉澱體(tǐ)積（PCV）20 μl加入200 μl 裂解液，混勻細胞沉澱，冰浴處理(lǐ)15分(fēn)鍾，間歇混勻。

注：2×10⁶ Jurkat細胞，其細胞沉澱體(tǐ)積（PCV，Packed Cell Volume）大(dà)約爲20 μl。

2.3 裂解細胞：

用玻璃勻漿器勻漿，直至充分(fēn)裂解或通過強烈渦旋震蕩使樣品裂解充分(fēn)。冰浴處理(lǐ)15分(fēn)鍾。

注：裂解混合物不建議(yì)使用超聲波破碎儀處理(lǐ)，因爲超聲波處理(lǐ)比較劇(jù)烈，容易破壞蛋白(bái)的相(xiàng)互作(zuò)用導緻蛋白(bái)變性。

2.4 離(lí)心收集上清：

充分(fēn)裂解後，4℃ 16000 g離(lí)心10分(fēn)鍾，取上清，即可(kě)進行後續的PAGE、Western和免疫沉澱等操作(zuò)。

3. 組織樣品蛋白(bái)提取：

3.1 手術(shù)切除的組織塊迅速置于預冷(lěng)的生(shēng)理(lǐ)鹽水中，漂洗數次，洗淨組織血迹，用濾紙吸幹組織表面液體(tǐ)，将組織切成細小的碎片。

3.2 按照(zhào)每20 mg組織加入200 μl裂解液的比例加入裂解液。(如(rú)果裂解不充分(fēn)可(kě)以适當添加更多的裂解液，如(rú)果需要高濃度的蛋白(bái)樣品，可(kě)以适當減少裂解液的用量。)

3.3 用玻璃勻漿器冰浴勻漿5-10次，收集勻漿後的裂解混合物。裂解物冰浴處理(lǐ)15分(fēn)鍾。

注：裂解混合物不建議(yì)使用超聲波破碎儀處理(lǐ)，因爲超聲波處理(lǐ)比較劇(jù)烈，容易破壞蛋白(bái)的相(xiàng)互作(zuò)用導緻蛋白(bái)變性。

3.4 充分(fēn)裂解後，4℃ 16000 g離(lí)心10分(fēn)鍾，取上清，即可(kě)進行後續的PAGE、Western和免疫沉澱等操作(zuò)。

實驗示例：