Western一抗二抗去(qù)除液（中性，劇(jù)烈型）

● 産品組成：

● 産品簡介：

Western抗體(tǐ)去(qù)除液（中性，劇(jù)烈型）(Western Antibody Stripping Buffer，neutral，harsh type)可(kě)以高效去(qù)除印迹膜上的一抗和二抗，而吸附在膜上的抗原基本不受影(yǐng)響，用于Western中轉移了蛋白(bái)的膜的重複利用，可(kě)以轉一次膜，做多次Western印迹實驗，通常可(kě)以重複利用膜2-3次。使用本試劑隻需大(dà)約20-30分(fēn)鍾即可(kě)實現蛋白(bái)膜的重複使用，然後可(kě)以進行Western的後續操作(zuò)。以每次使用5 ml Western抗體(tǐ)清除液計(jì)算，本産品可(kě)以使用20次。

該産品具有以下幾個優點：

1.可(kě)用于昂貴或珍稀樣本的多次雜交；

2.有利于用不同抗體(tǐ)分(fēn)析單次印迹上的不同蛋白(bái)，比如(rú)不同亞型的抗體(tǐ)；

3.有利于對異常結果進行重新分(fēn)析或确認；

4.有利于糾正孵錯的抗體(tǐ)；

5.節約試劑成本，并節約時間。

各種去(qù)除液的選擇請(qǐng)點擊Western一抗二抗去(qù)除液選擇指南(nán)。

● 貯存：

   按照(zhào)标簽溫度貯存，有效期一年(nián)；常溫運輸。

● 用前必讀(dú)：

1. 理(lǐ)想的抗體(tǐ)去(qù)除液應該是洗脫抗體(tǐ)的同時，不洗脫膜上結合的蛋白(bái)或者不改變抗原的結合性質，但(dàn)是目前沒有一種去(qù)除液可(kě)以做到隻洗脫抗體(tǐ)，而完全不洗脫膜上結合的抗原；也沒有一種去(qù)除液可(kě)以适用于所有不同親和度的抗原抗體(tǐ)複合物。去(qù)除液洗脫能力太強，抗原也容易被洗脫；太弱，則抗體(tǐ)殘留太高。因此，從(cóng)免疫印迹膜上去(qù)除抗體(tǐ)的方案僅能用于定性用途，因爲在每個抗體(tǐ)清除循環中，或多或少都(dōu)将洗去(qù)少量膜上的蛋白(bái)。

2. PVDF膜比硝酸纖維素膜（NC膜）更堅韌，因此優先推薦使用PVDF膜用于涉及抗體(tǐ)剝離(lí)的實驗。

3. 從(cóng)SDS-PAGE凝膠轉印完成後立即幹燥PVDF膜或NC膜，可(kě)改善蛋白(bái)質與膜的結合，特别推薦用于涉及多次抗體(tǐ)剝離(lí)的實驗。在第一輪抗體(tǐ)檢測之前，必須使用甲醇将幹燥的PVDF膜潤濕或用1×TBST将幹燥的NC膜潤濕。已經結合有抗體(tǐ)的膜，決不能使得(de)膜幹燥，否則抗體(tǐ)分(fēn)子将與膜結合緊密，很難剝離(lí)。因此，在做完一輪ECL發光(guāng)檢測實驗後，需要用清除液清除掉膜上的抗體(tǐ)，推薦将膜浸泡于1×TBS（非1×TBST）中4度保存。

4. 檢測時，優先檢測低豐度抗原：先孵育條帶較弱（表達較低）的蛋白(bái)，再孵育條帶明顯（表達較高）的蛋白(bái)，最後再孵育内參。

5. 如(rú)條件(jiàn)允許，下一輪的抗體(tǐ)雜交實驗選擇種屬來(lái)源不同的一抗（對應不同種屬的二抗），減少檢測的交叉反應。

6. 該清除液适用于ECL發光(guāng)檢測的膜上抗體(tǐ)清除，不适合于膜上直接顯色（DAB，BCIP/NBT等），不适合熒光(guāng)檢測。

● 使用說(shuō)明：

1. 在完成Western化學發光(guāng)檢測後，NC膜或PVDF膜用适量蒸餾水中震蕩漂洗5分(fēn)鍾；重複漂洗2次；1×TBST漂洗一次。

2. 棄1×TBST，加入适量的Western一抗二抗去(qù)除液和1/100體(tǐ)積的增強劑（例如(rú)使用5 ml去(qù)除液，加50 μl 增強劑）；在搖床上震蕩漂洗20-30分(fēn)鍾（轉速70 -80 rpm）。

3. 棄去(qù)除液，加入足量蒸餾水，在搖床上漂洗2次，每次5分(fēn)鍾，把去(qù)除液徹底漂洗幹淨。

  注：殘餘的去(qù)除液會影(yǐng)響後續抗原抗體(tǐ)的的結合。

4. 可(kě)選步驟：漂洗後的轉印膜孵育ECL發光(guāng)液，檢測二抗的清除效率。曝光(guāng)5分(fēn)鍾，膜上看(kàn)不到發光(guāng)條帶表明二抗清除得(de)比較幹淨。如(rú)果膜上能看(kàn)到條帶，重複步驟2-3。

5．繼續進行Western的後續操作(zuò)（封閉-抗體(tǐ)孵育-發光(guāng)檢測）。

● 實驗示例：

Western一抗二抗去(qù)除液檢測效果圖

樣品：293細胞，Ball-1細胞總蛋白(bái)(TP)，胞漿蛋白(bái)(C-Pr)，核蛋白(bái)(N-Pr)

電泳條件(jiàn)：12% SDS-PAGE（貨号:RTD6132） 200 V 1×TGS  53 min

轉膜條件(jiàn)：NC膜，1×RealBlot 恒流400 mA 35 min

封閉：無蛋白(bái)快(kuài)速封閉液  RT  60 min

一抗：TBP鼠單抗 1:5000  RT 60min孵育(圖一)

      GAPDH兔多抗 1:2000 RT 60 min孵育(圖三)

二抗：羊抗鼠IgG-HRP 1:5000  RT 60min(圖一)

      羊抗兔IgG-HRP 1:5000 RT 60 min (圖三)

抗體(tǐ)去(qù)除：NC膜蒸餾水漂洗3次，加入5 ml抗體(tǐ)去(qù)除液和50 μl 增強劑，常溫，搖床 30 min

ECL曝光(guāng)5分(fēn)鍾（圖二），ECL曝光(guāng)2秒（圖一，圖三）