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Western一抗二抗去(qù)除液(酸性,溫和型)

Western一抗二抗去(qù)除液(酸性,溫和型)

産品編号:WS1090-100ml

産品規格:100ml

相(xiàng)關規格:
數量
價格 ¥150

Western一抗二抗去(qù)除液(酸性,溫和型)

貨号

名稱

規格

WS1090-100ml

Western一抗二抗去(qù)除液(酸性,溫和型)

100 ml

WS1090-500ml

Western一抗二抗去(qù)除液(酸性,溫和型)

500 ml







● 産品簡介:

Western一抗二抗去(qù)除液(酸性,溫和型)(Western Antibody Stripping Buffer,acid,mild type)可(kě)以高效去(qù)除印迹膜上的一抗和二抗,而吸附在膜上的抗原基本不受影(yǐng)響,用于Western中轉移了蛋白(bái)膜的重複利用,可(kě)以轉一次膜,做多次Western印迹實驗,通常可(kě)以重複利用膜5-8次(PVDF膜)。使用本試劑隻需大(dà)約20-30分(fēn)鍾即可(kě)實現蛋白(bái)膜的重複使用,然後可(kě)以進行Western的後續操作(zuò)。

該産品具有以下幾個優點:

1.可(kě)用于昂貴或珍稀樣本的多次雜交;

2.有利于用不同抗體(tǐ)分(fēn)析單次印迹上的不同蛋白(bái),比如(rú)不同亞型的抗體(tǐ);

3.有利于對異常結果進行重新分(fēn)析或确認;

4.有利于糾正孵錯的抗體(tǐ);

5.節約試劑成本,并節約時間。

各種去(qù)除液的選擇請(qǐng)點擊Western一抗二抗去(qù)除液選擇指南(nán)

● 貯存:

   4℃貯存,有效期一年(nián);常溫運輸。

● 用前必讀(dú):

1. 理(lǐ)想的抗體(tǐ)去(qù)除液應該是洗脫抗體(tǐ)的同時,不洗脫膜上結合的蛋白(bái)或者不改變抗原的結合性質,但(dàn)是目前沒有一種去(qù)除液可(kě)以做到隻洗脫抗體(tǐ),而完全不洗脫膜上結合的抗原;也沒有一種去(qù)除液可(kě)以适用于所有不同親和度的抗原抗體(tǐ)複合物。去(qù)除液洗脫能力太強,抗原也容易被洗脫;太弱,則抗體(tǐ)殘留太高。因此,從(cóng)免疫印迹膜上去(qù)除抗體(tǐ)的方案僅能用于定性用途,因爲在每個抗體(tǐ)清除循環中,或多或少都(dōu)将洗去(qù)少量膜上的蛋白(bái)。

2. PVDF膜比硝酸纖維素膜(NC膜)更堅韌,因此優先推薦使用PVDF膜用于涉及抗體(tǐ)剝離(lí)的實驗。

3. 從(cóng)SDS-PAGE凝膠轉印完成後立即幹燥PVDF膜或NC膜,可(kě)改善蛋白(bái)質與膜的結合,特别推薦用于涉及多次抗體(tǐ)剝離(lí)的實驗。在第一輪抗體(tǐ)檢測之前,必須使用甲醇将幹燥的PVDF膜潤濕或用1×TBST将幹燥的NC膜潤濕。已經結合有抗體(tǐ)的膜,決不能使得(de)膜幹燥,否則抗體(tǐ)分(fēn)子将與膜結合緊密,很難剝離(lí)。因此,在做完一輪ECL發光(guāng)檢測實驗後,需要用清除液清除掉膜上的抗體(tǐ),推薦将膜浸泡于1×TBS(非1×TBST)中4度保存。

4. 檢測時,優先檢測低豐度抗原:先孵育條帶較弱(表達較低)的蛋白(bái),再孵育條帶明顯(表達較高)的蛋白(bái),最後再孵育内參。

5. 如(rú)條件(jiàn)允許,下一輪的抗體(tǐ)雜交實驗選擇種屬來(lái)源不同的一抗(對應不同種屬的二抗),減少檢測的交叉反應。

6. 該清除液适用于ECL發光(guāng)檢測的膜上抗體(tǐ)清除,不适合于膜上直接顯色(DAB,BCIP/NBT等),不适合熒光(guāng)檢測。

● 使用說(shuō)明:

1. 在完成Western化學發光(guāng)檢測後,NC膜或PVDF膜用适量蒸餾水中震蕩漂洗5分(fēn)鍾;重複漂洗2次。

2. 棄蒸餾水,加入适量的Western一抗二抗去(qù)除液,常溫(25℃)在搖床上震蕩漂洗20-30分(fēn)鍾(轉速70 -80 rpm)。 孵育溫度和時間會明顯影(yǐng)響抗體(tǐ)去(qù)除效果,參照(zhào)下表調整。

操作(zuò)溫度

震蕩清除時間

備注

18

30分(fēn)鍾以上

冬天實驗室氣溫低時

25

20-30 分(fēn)鍾

常規樣品操作(zuò)

37

15-20分(fēn)鍾

膜上蛋白(bái)含量高的樣品或清除與膜親和力高的抗體(tǐ)

3. 棄去(qù)除液,加入足量蒸餾水,在搖床上漂洗2次,每次5分(fēn)鍾,把去(qù)除液徹底漂洗幹淨。

  注:殘餘的去(qù)除液會影(yǐng)響後續抗原抗體(tǐ)的的結合。

4. 可(kě)選步驟:漂洗後的轉印膜孵育ECL發光(guāng)液,檢測二抗的清除效率。曝光(guāng)5分(fēn)鍾,膜上看(kàn)不到發光(guāng)條帶表明二抗清除得(de)比較幹淨。如(rú)果膜上能看(kàn)到條帶,重複步驟2-3。

5.繼續進行Western的後續操作(zuò)(封閉-抗體(tǐ)孵育-發光(guāng)檢測)。

   注:建議(yì)每次膜剝離(lí)後都(dōu)要進行重新封閉,以降低背景。

● 實驗示例:


Western一抗二抗去(qù)除液(酸性,溫和型)檢測效果圖

樣品:K562細胞,SDS裂解液(貨号:RL1060)提取總蛋白(bái)

電泳條件(jiàn):12% RealPAGE預制膠(貨号:RTD6117-0012) 150 V 1×TGS  80 min

轉膜條件(jiàn):PVDF膜 孔徑0.45μm,1×RealBlot快(kuài)速轉膜液(貨号:RT5020) 恒流350 mA 35 min

封閉:無蛋白(bái)快(kuài)速封閉液(貨号:PF1070)常溫25℃搖床慢(màn)搖10 min

抗體(tǐ)去(qù)除步驟:膜蒸餾水漂洗3次,加入5 ml Western一抗二抗去(qù)除液(酸性,溫和型),常溫25℃,

搖床慢(màn)搖 20 min

圖1:一抗:PCNA鼠單抗 1:5000 ,常溫60 min孵育,羊抗鼠IgG-HRP 1:5000  RT 60min孵育,ECL曝光(guāng)2秒。

圖2:膜第1次清除後抗體(tǐ)去(qù)除效果檢測:膜水漂洗3次,TBST漂洗1次,ECL曝光(guāng)5分(fēn)鍾,膜上幾乎無可(kě)見(jiàn)條帶,說(shuō)明二抗去(qù)除幹淨。

圖3:膜第1次清除後,GAPDH檢測: GAPDH兔多抗 1:3000  RT 60 min孵育,羊抗兔IgG-HRP 1:5000  RT 60min,ECL曝光(guāng)30秒。

圖4:膜第2次清除後,H3檢測: H3鼠單抗 1:10000  RT  60 min孵育,羊抗鼠IgG-HRP 1:5000  RT 60min孵育,ECL曝光(guāng)3秒。

圖5:膜第3次清除後,β-Actin檢測:β-Actin鼠單抗 1:5000  RT  60 min孵育,羊抗鼠IgG-HRP 1:5000  RT 60min孵育,ECL曝光(guāng)29秒。

圖6:膜第4次清除後,PCNA檢測:PCNA鼠單抗 1:5000  RT  60 min孵育,羊抗鼠IgG-HRP 1:5000  RT 60min孵育,ECL曝光(guāng)2秒。



 
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